通痹合剂对佐剂性关节炎模型大鼠软骨保护作用的机制研究

　　　　 作者：刘晓玲，刘琼，陈光星，陈纪藩

【摘要】 【目的】观察通痹合剂对佐剂性关节炎模型(AA)大鼠软骨的保护作用及机制。【方法】选用Wistar大鼠，随机分为正常组、模型组、消炎痛组(剂量为26 mg·kg-1·d-1)、柳氮磺胺吡啶组(剂量为825 mg·kg-1·d-1)、通痹合剂组(剂量为30 g·kg-1·d-1)。除正常组外，其他组大鼠均采用弗氏完全佐剂(剂量为02 mg/只)尾根部注射复制AA模型。灌胃给药2周后，观测各组大鼠踝关节软骨组织病理形态变化及病理积分，采用免疫组化法检测各组大鼠软骨组织中金属蛋白酶3(MMP3)和组织金属蛋白酶抑制剂3(TIMP3)的表达。【结果】AA模型组大鼠因关节炎症及软骨破坏致病理积分显著升高(P&<001)，关节及软骨出现重度病理损伤，软骨组织MMP3表达显著升高，TIMP3表达显著降低(均P&<001)。通痹合剂组大鼠关节软骨组织病理积分显著降低(P&<001)，关节及软骨出现轻度病理损伤，软骨组织MMP3表达显著降低，TIMP3表达显著升高(均P&<001)，其作用与阳性对照药消炎痛相仿(P&>005)，但毒副作用小。【结论】通痹合剂治疗强直性脊柱炎(AS)的作用可能与其能调节MMP3/TIMP3平衡有关。

【关键词】 通痹合剂/药理学;强直性脊柱炎/中药疗法;软骨/病理学;疾病模型，动物;大鼠

强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一种脊柱慢性进行性炎症性疾病，主要累及脊柱和骶髂关节。病理表现中，软骨下组织被大量的浆细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和软骨细胞浸润，导致关节的侵蚀和硬化[1-2]。因此，关节的反复炎症，以及由此引起的软骨损害和骨化是AS的重要环节。研究表明[3-4] ：金属蛋白酶和金属蛋白酶抑制剂拮抗平衡的失调在软骨的合成与降解中起重要作用。临床研究表明[5]：通痹合剂治疗AS有较好的临床疗效。 为进一步探讨其作用机制，本研究从佐剂性关节炎模型(AA)大鼠关节破坏及金属蛋白酶3(MMP3)/组织金属蛋白酶抑制剂3(TIMP3)表达的角度进行了研究，现将结果报道如下。

　　1材料与方法

　　11动物雄性Wistar大鼠，体质量(100±10)g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，实验动物合格证编号： SCXK(沪)20070005。

　　12药品、试剂与仪器通痹合剂由广州中医药大学第一附属医院制剂室提供，消炎痛由青海大地药业有限公司提供，柳氮磺胺吡啶肠溶片由上海三维制药有限公司提供，结核杆菌(MTUBERCULOSISH37RA) 由美国Difco公司提供，矿物油(MINERALOI) 由美国Sigma公司提供，一抗肿瘤坏死因子α(TNFα)、MMP3、TIMP3、SAP试剂盒由博士德生物工程有限公司提供，RM2255脱水机、EG1140H包埋机、TP1020切片机、STAINERXL染色机均由德国LEICA公司提供，EX50光学显微镜由日本Olympus公司提供，Gerson加样器由德国Eppendorf公司提供，LX70倒置显微镜由日本Olympus公司提供。

　　13造模[6]及给药方法Wistar大鼠46只随机分为通痹合剂组、柳氮磺胺吡啶组、消炎痛组、模型组、正常组。除正常组(6只)外，其余大鼠(每组10只)均以体积分数75%酒精消毒尾根部，用弗氏完全佐剂(2 mg/mL)按 02 mg/只的剂量皮下注射。造模后12 d，除模型组、通痹合剂组各1只外，其余大鼠出现肢体肿胀，说明造模成功，开始灌胃给药。正常组正常饮食，模型组每天给予生理盐水10 mL/kg，通痹合剂组(剂量为30 g·kg-1·d-1)、柳氮磺胺吡啶组(剂量为825 mg·kg-1·d-1)、消炎痛组(剂量为26 mg·kg-1·d-1)均灌胃治疗2周。

　　14AA大鼠关节软骨组织病理积分评价取动物踝关节软骨组织，固定，切片，苏木素—伊红(HE)染色，对中性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞浸润，滑膜增生，血管翳形成，软骨和骨的破坏进行评价。评价标准[7]：Ⅰ(0) 正常：关节软骨表面光滑，未见软骨破坏，关节滑膜未见增生，未见炎症细胞浸润，评为0分。Ⅱ (+)轻度：关节腔内见炎性渗出，滑膜上皮轻度增生，滑膜轻度慢性炎性细胞浸润，关节软骨轻度破坏，评为1分。Ⅲ(++)中度：关节腔内见炎性渗出，滑膜上皮中度增生，滑膜中度慢性炎性细胞浸润，关节软骨中度破坏，评为2分。Ⅳ(+++)重度：关节腔内见炎性渗出，滑膜上皮重度增生，滑膜重度慢性炎性细胞浸润，关节软骨重度破坏，评为3分。

　　15MMP3、TIMP3免疫组织化学法检测取动物踝关节软骨组织，经体积分数10%福尔马林固定，常规包埋，石蜡切片;采用SP免疫组化染色法，观察软骨中MMP3、TIMP3的表达情况。随机检测5个高倍视野(×400)，计算每个视野的阳性面积比，取其平均值。阳性面积比为每个视野阳性面积占整个视野面积的百分率，以其作为阳性反应细胞密度(简称阳性密度)。评价方法[8]：(-)表示无染色信号，评分为0分;(+)表示染色信号呈细颗粒状，棕黄色，阳性细胞占总细胞数50%以下，评分为1分;(++)表示染色信号呈细颗粒状，棕黄色，阳性细胞占总细胞数50%以上，或染色信号呈粗颗粒状、块状，棕黑色，阳性细胞占总细胞数50%以下，评分为2分;(+++)表示染色信号呈粗颗粒状或块状，棕黑色，阳性细胞占总细胞数50%以上，评分为3分。

　　16统计学方法采用SPSS 130统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验，方差不齐采用t′检验，检验水平α=005。

　　2结果

　　21各组AA大鼠一般情况正常组大鼠皮毛光泽色白，精神佳，活泼，饮食正常。从第7天起，造模各组大鼠尾根部开始出现溃疡，后来逐渐愈合结痂;12 d起，造模各组大鼠后肢逐渐开始出现肿胀，个别大鼠前肢也出现肿胀，皮毛松散并变黄、无光泽，精神倦怠，易激惹，活动困难，饮食减少，体质量增长减慢。发病后1周(造模后第19天)，大鼠肿胀的肢体开始消退，饮食也有所恢复，体质量开始上升。治疗中共死亡6只大鼠，其中消炎痛组死亡4只，死于胃穿孔。柳氮磺胺吡啶组死亡2只，死于灌胃方法不当。

　　22各组对AA大鼠关节炎症及软骨破坏的影响表1结果表明：与正常组比较，AA大鼠均产生了关节炎症及软骨破坏(P&<001);与模型组比较，通痹合剂组、消炎痛组具有抗关节炎症及软骨保护作用(P&<001)，柳氮磺胺吡啶组无抗关节炎症及软骨保护作用(P&>005)。

　　23各组对AA大鼠软骨组织MMP3和TIMP3表达的影响表2结果表明：模型组AA大鼠软骨组织MMP3表达显著高于正常组、TIMP3表达显著低于正常组(P&<001)，通痹合剂组和消炎痛组具有下调AA大鼠软骨组织MMP3表达、上调AA大鼠软骨组织TIMP3表达的作用(P&<001)，柳氮磺胺吡啶组对AA大鼠软骨组织MMP3、TIMP3表达无显著影响(P&>005)。表1各组AA大鼠关节软骨组织病理积分比较(x±s)表2各组AA大鼠软骨组织MMP3和TIMP3表达比较(x±s)

　　24各组大鼠关节病理形态观察图1(彩图见第318页)结果显示：正常组关节软骨表面光滑，关节滑膜未见增生，未见炎症细胞浸润。模型组关节腔内见大量炎性细胞渗出，滑膜上皮重度增生，滑膜重度慢性炎性细胞浸润，关节软骨重度破坏。消炎痛组和通痹合剂组关节腔内见炎性细胞渗出，滑膜上皮轻度增生，滑膜轻度慢性炎性细胞浸润，关节软骨轻度破坏。柳氮磺胺吡啶组关节腔内见炎性细胞渗出，滑膜上皮中度增生，滑膜中度慢性炎性细胞浸润，关节软骨中度破坏。

　　25各组大鼠软骨组织MMP3染色结果图2(彩图见第318页)结果显示：通痹合剂组与消炎痛组中MMP3染色信号呈细颗粒状，棕黄色，阳性细胞占总细胞数50%以下，表达较弱，模型组染色信号呈块状，棕黄色，阳性细胞占总细胞数50%以上，表达较强。柳氮磺胺吡啶组介于两者之间。

　　26各组大鼠软骨组织TIMP3染色结果图3(彩图见第318页)结果显示：通痹合剂组与消炎痛组的TIMP3染色信号呈粗颗粒状或块状，棕黑色，阳性细胞占总细胞数50%以上，表达较强。模型组染色信号呈细颗粒状，棕黄色，阳性细胞占总细胞数50%以下，表达较弱。柳氮磺胺吡啶组介于两者之间。

　　3讨论

　　目前世界范围内尚未建立起同人AS病变一致的动物模型，而在AS的病理表现中，其滑膜下组织炎症，滑膜增生，血管翳形成，软骨破坏，骨质减少，新骨形成，关节间隙变窄，这些基本病理改变与佐剂性关节炎模型(AA)的病理改变是一致的。鉴于此，本实验采用AA大鼠模型进行动物实验研究。

　　AS患者脊柱在影像学中早期表现为椎体骨质疏松和方形变，椎旁韧带钙化以及骨桥形成，晚期出现广泛而严重的软骨骨化性骨桥表现，称为“竹节样脊柱”，耻骨联合、坐骨结节和肌腱附着点(如跟骨)的骨质糜烂，伴邻近骨质的反应性硬化及绒毛状改变，软骨可出现新骨形成[1-2]。病理表现中，软骨下组织被大量的浆细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和软骨细胞浸润，导致关节的侵蚀和硬化。因此，关节的反复炎症，以及由此引起的软骨损害和骨化是AS的重要环节，而抑制关节炎症，保护软骨并防止其骨化成为治疗AS的关键。

　　在AS关节炎的病变过程中，软骨合成与降解的动态平衡遭到破坏，软骨逐渐降解，随后出现骨侵蚀[1-2]。影响软骨合成与降解的因素包括：生长因子与细胞因子的参与，金属蛋白酶和金属蛋白酶抑制剂拮抗平衡的失调等[3-4]。软骨基质的降解主要由金属蛋白酶介导，其中以金属蛋白酶1(MMP1)、MMP3为主。MMP1(胶原酶)可降解Ⅱ、Ⅳ型胶原及聚合素，MMP3(间质溶素)主要降解蛋白多糖[3-4](本实验以MMP3为代表)。TIMP是软骨组织中对抗蛋白酶作用的主要物质[3-4] (本实验以TIMP3为代表)。总之，软骨破坏与细胞因子和生长因子、蛋白酶和蛋白酶抑制物关系密切，调节炎症性细胞因子与生长因子，MMPs及其抑制剂的平衡将成为今后治疗AS的重要途径[2]。本实验对AA大鼠模型进行病理切片中关节破坏程度的评价，采用免疫组化法检测软骨组织中MMP3和TIMP3的表达，从金属蛋白酶及其抑制剂的角度研究防止软骨骨化在治疗AS过程中的重要作用。结果表明通痹合剂具有抗关节炎症、减轻关节软骨破坏的作用，推测这一作用可能与其下调MMP3表达、上调TIMP3表达有关。

　　AS属于中医学痹证范畴，通痹合剂主要由南蛇藤和鸡血藤两味药组成，具有祛风除湿，活血通络，修复筋伤骨损，改善患者关节功能等作用。前期临床研究表明通痹合剂可减轻患者疼痛、晨僵程度，降低血沉、C反应蛋白，改善患者脊柱活动度，且毒副作用小[3]，但其机理不明。本研究通过动物实验研究，拟观察通痹合剂是否通过下调MMP3表达、上调TIMP3表达水平而阻断软骨基质的降解，达到减轻关节破坏的效果，从而起到较好的临床疗效。结果提示通痹合剂对AS的治疗作用与其协调金属蛋白酶及其抑制剂的平衡有关。

　　消炎痛是经典的非甾体类抗炎药，有显著的抗炎止痛效果，本研究也证实了其可靠的治疗效果，但10只消炎痛大鼠，在2周的灌胃治疗中4只死于胃穿孔，死亡率为40%，其毒副作用较明显。柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine，SSZ)是治疗AS的慢作用抗风湿药(DMARDs)中研究最多的药物。SSZ能抑制白细胞游动，降低蛋白溶解酶活性，抑制多种细胞因子如白细胞介素6、白细胞介素1a、白细胞介素1b、肿瘤坏死因子等，特别适宜于改善AS患者外周关节的滑膜炎，而对脊柱关节病变的作用至今尚无定论，且起效缓慢。本研究结果表明治疗14 d后，SSZ对TIMP3表达的影响与模型组比较差异无显著性意义。

　　本研究及前期研究结果表明，中药复方制剂通痹合剂不仅可以改善症状而且可以改善病情，其治疗AS的机理之一可能与其下调软骨组织MMP3表达、上调TIMP3表达，恢复其平衡有关。通痹合剂安全、毒副作用小，既有类似非甾体类抗炎药作用，又有类似其改善病情的作用，其作用机理有待进一步研究。

参考文献

　[1] Francois R J. Axial pathology in ankylosing spondylitis[J].Ann Rheum Dis，2000，59：997.

　　[2]Laloux L，Voisin M C，Allain J，et al.Immunohistological study of entheses in spondyloarthropathies：comparison in rheumatoid arthritis and osteoarthritis[J].Ann Rheum Dis，2001，60：316.

　　[3]Overall C M.Regulation of tissue inhibition of matrix metalloproteinase expression[J]. Ann NY Acad Sci，1994，9(6)：51.

　　[4]Woessner J F.Matrix metalloproteinases and their inhibitors in connective tissue remodeling[J].Faseb J，1991，5:2145.

　　[5]林昌松，刘晓玲.陈纪藩教授治疗强直性脊柱炎经验[J].新中医，2001，33(2):10.

　　[6]Easser R E，Hildebrand A R，Angelo R A，et a1.Measurement of radiographic changes in adjuvantinduced arthritis in rats by quantitative image analysis[J].Arthritis Rheum，1995，38:129.

　　[7]Takayanagi H H，Juji T，Miyazaki T，et a1.Suppression of arthritic bone destruction by adenovirusmediated csk gene transfer to synoviocytes and osteoblasts[J].J Clin Invest，1999，104:137.

　　[8] Nielsen T O，Hsu F D，Jansen K，et al.Immunohistochemical and clinical characterization of the basallike subtype of invasive breast carcinoma[J]. Clin Cancer Res，2004，10(16):5367.

　　在AS关节炎的病变过程中，软骨合成与降解的动态平衡遭到破坏，软骨逐渐降解，随后出现骨侵蚀[1-2]。影响软骨合成与降解的因素包括：生长因子与细胞因子的参与，金属蛋白酶和金属蛋白酶抑制剂拮抗平衡的失调等[3-4]。软骨基质的降解主要由金属蛋白酶介导，其中以金属蛋白酶1(MMP1)、MMP3为主。MMP1(胶原酶)可降解Ⅱ、Ⅳ型胶原及聚合素，MMP3(间质溶素)主要降解蛋白多糖[3-4](本实验以MMP3为代表)。TIMP是软骨组织中对抗蛋白酶作用的主要物质[3-4] (本实验以TIMP3为代表)。总之，软骨破坏与细胞因子和生长因子、蛋白酶和蛋白酶抑制物关系密切，调节炎症性细胞因子与生长因子，MMPs及其抑制剂的平衡将成为今后治疗AS的重要途径[2]。本实验对AA大鼠模型进行病理切片中关节破坏程度的评价，采用免疫组化法检测软骨组织中MMP3和TIMP3的表达，从金属蛋白酶及其抑制剂的角度研究防止软骨骨化在治疗AS过程中的重要作用。结果表明通痹合剂具有抗关节炎症、减轻关节软骨破坏的作用，推测这一作用可能与其下调MMP3表达、上调TIMP3表达有关。

　　AS属于中医学痹证范畴，通痹合剂主要由南蛇藤和鸡血藤两味药组成，具有祛风除湿，活血通络，修复筋伤骨损，改善患者关节功能等作用。前期临床研究表明通痹合剂可减轻患者疼痛、晨僵程度，降低血沉、C反应蛋白，改善患者脊柱活动度，且毒副作用小[3]，但其机理不明。本研究通过动物实验研究，拟观察通痹合剂是否通过下调MMP3表达、上调TIMP3表达水平而阻断软骨基质的降解，达到减轻关节破坏的效果，从而起到较好的临床疗效。结果提示通痹合剂对AS的治疗作用与其协调金属蛋白酶及其抑制剂的平衡有关。

　　消炎痛是经典的非甾体类抗炎药，有显著的抗炎止痛效果，本研究也证实了其可靠的治疗效果，但10只消炎痛大鼠，在2周的灌胃治疗中4只死于胃穿孔，死亡率为40%，其毒副作用较明显。柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine，SSZ)是治疗AS的慢作用抗风湿药(DMARDs)中研究最多的药物。SSZ能抑制白细胞游动，降低蛋白溶解酶活性，抑制多种细胞因子如白细胞介素6、白细胞介素1a、白细胞介素1b、肿瘤坏死因子等，特别适宜于改善AS患者外周关节的滑膜炎，而对脊柱关节病变的作用至今尚无定论，且起效缓慢。本研究结果表明治疗14 d后，SSZ对TIMP3表达的影响与模型组比较差异无显著性意义。

　　本研究及前期研究结果表明，中药复方制剂通痹合剂不仅可以改善症状而且可以改善病情，其治疗AS的机理之一可能与其下调软骨组织MMP3表达、上调TIMP3表达，恢复其平衡有关。通痹合剂安全、毒副作用小，既有类似非甾体类抗炎药作用，又有类似其改善病情的作用，其作用机理有待进一步研究。

参考文献

　[1] Francois R J. Axial pathology in ankylosing spondylitis[J].Ann Rheum Dis，2000，59：997.

　　[2]Laloux L，Voisin M C，Allain J，et al.Immunohistological study of entheses in spondyloarthropathies：comparison in rheumatoid arthritis and osteoarthritis[J].Ann Rheum Dis，2001，60：316.

　　[3]Overall C M.Regulation of tissue inhibition of matrix metalloproteinase expression[J]. Ann NY Acad Sci，1994，9(6)：51.

　　[4]Woessner J F.Matrix metalloproteinases and their inhibitors in connective tissue remodeling[J].Faseb J，1991，5:2145.

　　[5]林昌松，刘晓玲.陈纪藩教授治疗强直性脊柱炎经验[J].新中医，2001，33(2):10.

　　[6]Easser R E，Hildebrand A R，Angelo R A，et a1.Measurement of radiographic changes in adjuvantinduced arthritis in rats by quantitative image analysis[J].Arthritis Rheum，1995，38:129.

　　[7]Takayanagi H H，Juji T，Miyazaki T，et a1.Suppression of arthritic bone destruction by adenovirusmediated csk gene transfer to synoviocytes and osteoblasts[J].J Clin Invest，1999，104:137.

　　[8] Nielsen T O，Hsu F D，Jansen K，et al.Immunohistochemical and clinical characterization of the basallike subtype of invasive breast carcinoma[J]. Clin Cancer Res，2004，10(16):5367.