银杏叶提取物联合灯盏细辛对视网膜神经节细胞的保护作用

　　　　　　作者：王明良，费志刚，李红，贺美宁

【摘要】 　　目的：探讨银杏叶提取物联合灯盏细辛对兔慢性高眼压模型视网膜神经节细胞的保护作用。方法：采用α糜蛋白酶(0.2mL)(2667.2μkat)注入家兔眼后房，造成实验性慢性高眼压。将造模成功的32只家兔随机分为4组，每组8只，分别给予以下治疗:银杏叶提取物150mg/kg(银杏叶组) ；灯盏细辛150mg/kg(灯盏细辛组) ；银杏叶提取物联合灯盏细辛皆灌胃，1次/d银杏叶提取加灯盏细辛（联合用药组）；不做任何治疗(模型对照组)。4wk后各组分别进行视网膜神经节细胞凋亡检测正常视神经节细胞计数和光镜观察视网膜各层病理改变。结果：每组均可观察到阳性细胞，正常神经节细胞计数最多为联合用药组(889.00±40/mm2 )、最少为模型对照组(581±24/mm2)，P&<0.01 ，光镜下模型对照组视网膜各层结构最紊乱，联合用药组视网膜各层组织最完整。结论：银杏叶提取物联合灯盏细辛能阻止高眼压导致视网膜神经节细胞发生凋亡。

【关键词】 银杏叶提取物；灯盏细辛；慢性高眼压；神经节细胞；细胞凋亡

　　AbstractAIM: To study the protective effect of Ginaton and fleabane on retinal ganglion cells in rabbit chronic high intraocular pressure model.METHODS: Chronic high intraocular pressure was created by injecting αchymotrypsin(0.2mL)(2667.2μkat) into rabbit posterior chamber. Thirtytwo rabbits of successful model were pided randomly into four groups， with 8 rabbits in each group， and then treated with different therapies as follows：intragastric administration with Ginaton 150mg/kg， once a day (Ginaton group); intragastric administration with fleabane 150mg/kg， once a day (fleabane group)；intragastric administration with Ginaton and fleabane(combination therapy group)and control group. After 4 weeks of treatment， all groups were checked retinal ganglion cells apoptosis， normal ganglion cells counting ，pathological changes of retinal layers with light microscopy.RESULTS: Positive cells could be found in every group， the number of normal retinal ganglion cells was the largest in combination therapy group(889.00±40/mm2 )， the least in control group(581±24/mm2 )，P&<0.01. In light microscopy， the worst arrangement of retinal layers was in control group， and the best was in combination therapy group.
CONCLUSION: Ginaton and fleabane could prevent high intraocular pressure caused apoptosis of retinal ganglion cells.
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　　KEYWORDS: Ginaton；fleabane；chronic high intraocular pressure；retinal ganglion cell；apoptosis

　　0引言

　　近年来视神经节细胞（retinal ganglion cells， RGCs）保护作用备受关注，慢性高眼压视神经损害本质为RGCs的凋亡和丢失。现代研究表明，RGCs的凋亡是可以阻止的，受损RGCs的轴可以再生并重新恢复功能。青光眼RGCs的保护与再生治疗在青光眼的治疗中日益受到重视。祖国医学银杏叶提取物具有抗氧化作用；抗缺血作用；具有抑制谷氨酸受体毒性兴奋作用；一氧化氮合酶抑制作用，一氧化氮也是神经节细胞凋亡的一个关键因素，过量的一氧化氮使神经节细胞凋亡。银杏叶提取物是过氧化物，一氧化氮的清除剂并能抑制一氧化氮的产生[1]。灯盏细辛针对视网膜/视神经的系列实验研究结果表明，灯盏细辛能提高RGCs抗损伤的能力[2]，经多次临床观察证明灯盏细辛有扩大视野，提高视网膜光敏感度和部分改善原有视野缺损的作用[3] 。我们将银杏叶提取物联合灯盏细辛应用于慢性高眼压模型，进行视网膜视神经节细胞凋亡检测及光镜观察视网膜各层病理改变。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　成年健康新西兰白兔体质量2.0～2.5kg ，无眼疾，雌雄不限共32只，由南华大学实验动物中心提供。1mL 一次性注射器，α糜蛋白酶溶液，毛果芸香碱滴眼液，的卡因溶液，甲醛溶液，直接检眼镜，Schiotz眼压计，AgNOR 染色液，乌拉坦溶液，银杏叶提取物，灯盏细辛，TUNEL试剂盒，光学显微镜。

　　1.2方法

　　造模均选取家兔右眼。10g/L毛果芸香碱滴眼液缩瞳，200g/L乌拉坦溶液行全身麻醉5mL/kg，用1mL 注射器自角巩膜缘内1mm 处刺入前房，抽出房水约0.20mL，再置换装有α 糜蛋白酶溶液0.20mL（13336μkat/L）的针管，将针头经瞳孔缘进入对侧虹膜后面即后房，注入α 糜蛋白酶溶液后出针[4]。造模后测量24及72h的眼压，24h后眼压&>30mmHg ，72h眼压&> 26.6mmHg 为造模成功[5]。将造模成功的家兔随机分为4组，每组8眼。于造模后72h开始治疗，共治疗4wk 。治疗方法如下：银杏叶A组:银杏叶提取物150mg/kg灌胃，1次/d；灯盏细辛B组：灯盏细辛150mg/kg灌胃，1次/d；联合用药C组：银杏叶提取物联合灯盏细辛灌胃，1次/d；模型对照D组：不予任何治疗。各组兔于开始治疗29d经耳缘静脉注射空气栓塞致死，立即摘取眼球，在眼球赤道部用5mL注射器抽取部分眼内组织后置换等量的甲醛溶液，置入甲醛溶液固定24h，石蜡包埋，切片，HE染色，制成切片后用Olympus光学显微镜观察视网膜各层病理改变。标本用戊二醛多聚甲醛前固定，鹅酸后固定，0.1mol/L PBS 液漂洗3次，梯度乙醇脱水，环氧树酯包埋，LKBV型超薄切片机切片，J EOJ 100CX透射电镜观察细胞超微结构。标本用甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片，TUNEL 法检测严格按照TUNEL 细胞凋亡原位检测试剂盒的操作说明进行，棕黄色细胞即为凋亡阳性细胞，正常节细胞呈绿色。将切片用双蒸水洗2 次， 入AgNOR工作液中暗处浸染25～30min， 双蒸水洗3次， 无水乙醇洗2次， 入二甲苯：石碳酸(4∶1) 1min， 二甲苯透明， 国产中性树胶封固。光镜下观察组织结构形态和细胞核内AgNOR黑色银染颗粒情况检测RGCs的活性。

　　统计学分析：节细胞计数以±s 表示，采用SPSS 17.0软件包行两样本均数t检验。P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1视网膜节细胞

　　模型对照组神经节细胞计数（581±24/mm2）最少，表明模型对照组其视网膜受损最严重;银杏叶组（693±27/mm2）、灯盏细辛组（710±30/mm2）与模型对照组比较差异有统计学意义，证明了银杏叶提取物，灯盏细辛对视网膜有一定的保护作用，其与联合用药组（889±40/mm2）显著的差异性说明两种药物联合保护作用更突出。模型对照组内丛状层变薄甚至消失，内核层、外核层细胞数目减少、间隙扩大，排列紊乱，节细胞层明显变薄;联合用药组各层组织结构清晰，层次分明，细胞排列整齐，接近正常视网膜;银杏叶组，灯盏细辛组各层均有不同程度的变薄 。凋亡细胞胞膜完整，细胞体积缩小，线粒体肿胀，细胞核沿核膜皱缩，染色质浓缩、边集，有的核膜裂解，染色质分割成块。

　　2.2 AgNOR染色

　　光镜下可见细胞和细胞外组织被染成浅黄色，细胞核染成棕黄色，边界清楚，核内可见分散的一个或多个AgNOR小黑点，有时可见许多细小颗粒融合成不规则团块状。联合用药组节细胞核内银染颗粒分布均匀，灯盏细辛组和银杏叶提取物组节细胞核内银染颗粒明显减少，模型对照组减少最多，联合用药组与银杏叶提取物组、灯盏细辛组、模型对照组差异都具有显著性（P&<0.05）。

　　3讨论
　　
　　α糜蛋白酶溶液后房注射可制作兔慢性高眼压模型，α糜蛋白酶是一种蛋白水解酶， 它可以水解晶状体悬韧带，经后房注射后，晶状体悬韧带被水解成碎片随房水进入房水循环，阻塞房角、Schlemm管及小梁组织至眼压升高，眼压升高发生快、持续久、程度高[6]。0.5h后眼压可达50mmHg以上，72h后眼压维持在30～40mmHg之间，直到第4wk，眼压仍在25mmHg左右。视网膜神经节细胞层在持续高眼压状态下最易受损，节细胞大量凋亡，TUNEL 法检测后，发生凋亡的节细胞呈现棕黄色阳性反应，而正常节细胞呈现绿色阴性反应。电镜下见到的阳性细胞均呈现凋亡的病理改变。成为视神经保护药物的一个重要原则是该药物能够通过眼组织达到视网膜，即该药必须和靶细胞或靶组织接触从而发挥药物作用。给大鼠口服放射性元素标记的银杏叶提取物，发现银杏叶提取物可以在视网膜上达到足够的药物浓度。银杏叶组、灯盏细辛组与模型对照组比较差异有统计学意义，证明了银杏叶提取物，灯盏细辛对视网膜有一定的保护作用，其与联合用药组显著的差异性说明两种药物联合保护作用更突出。银杏叶主要含有银杏黄酮，银杏黄酮类是低分子量化合物，均衍生于其母体化合物黄酮，以糖苷和甲基化合物形成存在。已知银杏叶含黄酮类化合物35种，其中双黄酮6种、银杏黄酮苷元7种、黄酮苷17种。香港学者的研究也表明含有银杏叶提取物的中药制剂对高眼压的大鼠视神经具有一定的保护作用[7]，研究表明银杏叶提取物中的内酯成分具有扩张血管的作用，特别是可扩张微循环，增加微循环血流。正常志愿者口服银杏叶提取物后，彩色多普勒显示眼动脉血流量增加了24%。而银杏叶提取物中的黄酮成分则有抗氧化的作用，包括对抗脂质过氧化。此外，银杏叶提取物还具有多种作用，比如，抑制NMDA受体毒性兴奋，阻断谷氨酸毒性作用，抑制血小板聚集，对抗凋亡等。它对缺血缺氧，机械损伤导致的神经元损伤有保护作用。

　　一般认为，一旦青光眼出现视盘的严重损伤，即使眼压被控制，恢复视功能亦非常困难，甚至是不可能的。但是一些研究认为，青光眼损伤分为原发性损伤和继发性变性，那些逃避了原发损伤的正常神经元，因为临近已发生损伤的神经元产生的变性损伤微环境，而导致继发变性。因此，对这些RGC及其轴突的保护和再生治疗已越来越受到重视。灯盏细辛是一种云南民间中草药，具有抗血栓，减少外周血管阻力，改善大脑及抗血小板聚集的作用。动物实验已证实EBHM注射液具有改善鼠实验性高眼压后视神经轴浆运输及减轻急性高眼压后RGC组织学改变的作用[2]，其可能使某些濒临死亡的RGC轴索恢复轴浆运输，从而避免部分RGC的死亡。我们的实验结果表明联合用药组的RNFL厚度和RGC密度显著高于单纯用药组。提示银杏叶提取物和灯盏细辛对视神经节细胞保护作用机制有相辅相成的因素。

　　综上所述，高眼压能导致视网膜神经节细胞发生凋亡，银杏叶提取物和灯盏细辛对视神经均有一定的保护作用，其联合对视神经的保护作用更显著。

参考文献

　　1 Marcocci L， Maguire JJ， DroyLefaix MT， et al. The nitric oxidescavenging properties of Ginkgo iloba extract EGb761. Biochem Biophys Res Commun 1994;201(2):748755

　　2朱益华，蒋幼芹，刘忠浩，等.灯盏细辛注射液对鼠实验性高眼压视神经轴浆运输的影响.中华眼科杂志 2000;36(4)：289

　　3贾莉君，刘忠浩，罗学港，等.青光康注射液对急性实验性高眼压大鼠视网膜神经节细胞代谢的作用.中华眼科杂志 1995;31(2)：129132

　　4李养军，杨新光，高玫蕊.银杏叶黄酮对兔实验性高眼压后视网膜组织氢氧根自由基的影响.眼科研究2003；21（1）：2931

　　5陈飞.关于视网膜神经节细胞凋亡的最新进展.国外医学眼科分册2000；23（3）：201202

　　6 Kalvin NH. Experimental glaucoma in monkeys. Arch Ophthalmol 1998;75:89
　　
　　7 Cheung ZH， So KF， Lu Q， et al. Enhanced survival and regeneration of axotomized retinal ganglion cells by a mixture of herbal extracts. J Neurotrauma 2002;19(3):369378