重组胸腺素β4调节NFκB表达促进兔角膜碱烧伤后修复

　　　　 作者：龙安华，李明，王晓坤，司文，李玄德，聂李亚，马素永，车永哲，许松山

【摘要】 　　目的：探讨重组胸腺素β4（Thymosin β4， Tβ4）对角膜碱烧伤后角膜核转录因子κB（nuclear factor κB，NFκB）表达的影响和促进角膜愈合的观察。方法：用1mol/L NaOH浸透的6mm直径圆滤纸片贴于兔角膜中央30s，建立兔角膜碱烧伤模型。动物随机分为实验组和对照组，实验组给予低中高剂量（0.1，1，10μg/50μL）Tβ4，对照组给予PBS（阴性对照组）和rhEGF（阳性对照组）皆2次/d滴眼。烧伤后1， 3， 7， 14d肉眼观察角膜烧伤面积的变化，照相、统计愈合率；免疫组化染色检测NFκB和IL1β表达；取烧伤区角膜组织匀浆液提取细胞核蛋白，用ELISA检测NFκB的p65亚基表达水平。结果：角膜碱烧伤后Tβ4用药组角膜愈合率最高达到33.8%，相应阴性对照组为22.8%，Tβ4用药组显著高于对照组（P&<0.01），其中中剂量Tβ4组愈合率高于其他剂量组；Tβ4用药组NFκB免疫组化染色积分吸光度明显低于对照组（P&<0.05），ELISA检测NFκB的p65亚基，在Tβ4用药组中表达最少（P&<0.01），IL1β免疫组化染色阳性，但实验组和对照组差异无统计学意义。结论：重组Tβ4促进角膜碱烧伤修复，其机制可能与下调NFκB在细胞核内的表达相关。

【关键词】 碱烧伤;创伤愈合;胸腺素β4;基质金属蛋白酶2;血管内皮生长因子

　　AbstractAIM: To investigate the ability of Thymosin β4 (Tβ4) to promote healing in an alkali injury model in vivo and the mechanisms involved in that process which Tβ4 may be a potential antiinflammation agent in this model. METHODS: Corneas of the NewZealand Rabbit were chemically burned with a 6mm disc soaked in 1mol/L NaOH for 30 seconds. Eyes were irrigated copiously with saline and then treated topically with PBS(Negative control group)， rhEGF（jinyinshu drop， Positive control group）， and Tβ4 (0.1， 1， 10μg/50μL) twice daily. At the time point of 1 day， 3， 7， 14 days postburn， the healing rate of the cornea were examined and MMP2， TIMP2， VEGF immunostaining performed.RESULTS:Tβ4treated corneas demonstrated improved cornea healing rate of 33.8% vs PBStreated corneas of 22.8%(P&<0.01) ， 1μg/50μL Tβ4 seemed to be the best dosage. Whereas immunohistochemistry result suggested that Tβ4 decreased corneal NFκB expression(P&<0.01) after alkali injury， no change in IL( interleukin) 1β was detected(P&>0.05). The enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) result suggested that theres a significant decrease to the NFκB protein levels(P&<0.01). CONCLUSION: Tβ4 treatment decreases corneal inflammation and inhibits the expression of NFκB to improve cornea healing. The result have important clinical implications for the potential role of Tβ4 as a corneal antiinflammatory agent.

　　KEYWORDS: alkali injury; wound healing; Thymosin beta4; nuclear factorkappa B; interleukin1β

　　0引言

　　角膜碱烧伤是一种严重的角膜损伤。研究显示，角膜碱烧伤后许多促炎因子和细胞趋化因子表达增加[1]，这些促炎因子表达的增加导致角膜损伤部位白细胞和单核细胞浸润，组织破坏和溶解作用会导致角膜愈合的延迟。TNFα和IL1β是非常重要的调节炎症程度的细胞因子，它们在感染、组织损伤、恶性肿瘤和细胞凋亡等过程中通过启动炎症反应来抵抗外来物入侵[2]，但失控的炎症反应往往导致组织自身损伤，不利于组织愈合[3]。Tβ4是G肌动蛋白偶联蛋白，最近研究表明Tβ4能够调节肌动蛋白平衡，促进多种细胞迁移[4，5]，抑制炎症过度表达[6]，抑制细胞凋亡[7]等；在促进皮肤创伤愈合[8]，保护和修复心肌，促进角膜碱烧伤后修复[9]以及促进毛囊干细胞生长等方面具有很好的促进和调节作用。近年来研究显示Tβ4和其变异体Sulfoxide Tβ4，splicevariant Tβ4均有抑制炎症因子和促进组织创伤愈合的作用[10，11]。Tβ4在大鼠角膜清创术后能调节IL1和IL8表达并促进角膜再上皮化和角膜愈合，促炎因子TNFα和IL1β可以激活NFκB，NFκB是Rel家族的同源蛋白，最重要的两个亚基是p65和p50，被激活后以二聚体形式转位至细胞核内发挥转录因子活性，与细胞炎症过程密切相关。在角膜碱烧伤中NFκB的抑制剂SN50能加速角膜上皮细胞增殖促进角膜愈合[12]，Sosne等[6]首次报道Tβ4具有对NFκB的抑制作用，可以调节角膜碱烧伤后炎症反应的程度，是Tβ4促角膜修复的可能机制。我们观察Tβ4促进角膜碱烧伤后角膜愈合的情况下，并探讨Tβ4是否通过调节NFκB的机制发挥其抗炎作用。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　健康成年新西兰白兔（军事医学科学院实验动物中心提供），2.0～3.0kg，雌雄不限。60只动物随机分为实验组和对照组，实验组又分低剂量（0.1μg ）、中剂量（1μg）、高剂量（10μg）组，对照组分为PBS阴性对照组和rhEGF阳性对照组，每组12只，分别在1，3，7，14d各处死3只，快速取材完整兔角膜。重组Tβ4由北京诺思兰德生物技术有限公司提供，rhEGF滴眼液商品名为“金因舒”，由深圳市华生元基因工程发展有限公司生产（国药准字S20040006），抗兔IL1β一抗由武汉博士德生物工程有限公司提供，抗兔NFκB一抗由santa cruz Biotechnology， Inc提供，过氧化物酶和二抗等免疫组化试剂以及ELISA试剂盒均由天津灏洋生物制品科技有限公司提供。

　　1.2方法

　　1.2.1兔角膜碱烧伤模型制作

　　实验动物用20g/L利多卡因2mL局部浸润麻醉，自制开睑器开睑，用在40g/L NaOH浸透的直径为6 mm的圆滤纸片贴于两眼角膜中央，30s后迅速用无菌生理盐水冲洗5min，建立角膜碱烧伤模型。每天分别用3种剂量的Tβ4、无菌PBS和rhEGF滴眼液早晚两次滴眼。分别在1，3，7，14d取材，部分组织迅速固定于40g/L多聚甲醛固定液24h，经常规石蜡包埋，行水平连续切片（5μm），部分组织迅速冷冻备用。

　　1.2.2角膜愈合率检测

　　对14d取材的实验动物，角膜碱烧伤后每隔1d拍照角膜烧伤部位，Motic 3.0计算角膜愈合率，角膜愈合率=（1取材时角膜损伤面积/原始角膜损伤面积）×100%。

　　1.2.3 NFκB和IL1β表达的检测

　　每个角膜标本取1张切片行HE染色，观察组织学形态。再各取1张行NFκB和IL1β免疫组化染色，一抗（1∶50）4℃孵育过夜，相应的生物素标记的二抗（1∶200）室温45min，SP复合物室温孵育45 min，DAB显色，显微镜下控制并严格控制各组的反应时间，Mayer苏木精对比染色1min，常规封片。显微镜（Leica DM RXA2）观察并取角膜中央和角膜缘各3张图片，用于图像分析。

　　1.2.4细胞核内NFκB蛋白水平的检测

　　在各时间点取角膜组织后立即冷冻于70℃，液氮冷冻条件下研磨组织，再分别用自配胞质裂解液和胞核裂解液抽提胞质蛋白和胞核蛋白，胞核蛋白用于ELISA检测NFκB蛋白的p65亚基表达情况，操作均按试剂盒说明步骤进行。

　　统计学分析:对免疫组化染色的切片每组动物各取5张，显微镜照相取图时按照两角膜缘和损伤中央部位各取3张图，用Motic 3.0图像分析软件分析平均积分吸光度（IOD/Area），行两因素方差分析（Two way ANOVA）和Dunnettt检验，P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1烧伤愈合率

　　碱烧伤后11d时阴性对照和阳性对照组角膜愈合率分别为22.7%和21.4%，Tβ4用药组愈合率分别为22.2%，27.7%和33.8%，明显高于PBS阴性对照组（P&<0.01或P&<0.05）；Tβ4三个剂量组中中剂量组在3，5，7和9d时间点均高于其它剂量组，但差异无统计学意义（图1）。

　　2.2 NFκB和IL1β的表达

　　在烧伤后1和3d角膜上皮、内皮细胞胞质均为阳性，均匀分布，阳性部位以上皮细胞基底膜层和角膜边缘上皮最为明显，经平均积分光密度分析，Tβ4用药组和对照组阳性强度无统计学差异；7d各组染色仍为阳性，但Tβ4用药组染色强度比对照组低（P&<0.05）；14d Tβ4用药组明显阳性部位比对照组少，染色强度低（P&<0.01）。各时间点rhEGF阳性对照组与PBS阴性对照组无差异(P&>0.05)。IL1β免疫组化染色结果，靠近基底膜的角膜上皮、内皮层细胞胞质均有强阳性表达，基质层有散在表达的颗粒，但免疫阳性表达弱。平均积分光密度分析，在各个时间点，Tβ4用药组和对照组阳性强度无统计学差异。

　　2.3细胞核内NFκB水平

　　ELISA检测角膜细胞核NFκB p65亚基蛋白表达结果如图2，在1d rhEGF阳性对照组和阴性对照组、Tβ4各剂量组之间表达量无差异（P&>0.05）；3d NFκB在Tβ4用药组中表达显著降低（P&<0.01），而对照组NFκB表达跟1d相比无变化；7d和14d Tβ4用药组比对照组表达低（P&<0.01）。但Tβ4各剂量组之间差异没有规律。ELISA检测细胞核内NFκB p65亚基蛋白表达情况与免疫组化结果大致类似，但ELISA结果中NFκB表达下降时间点比免疫组化提前至3d。

　　3讨论
　　
　　Tβ4最初被认为是一种G肌动蛋白偶联蛋白，能与G肌动蛋白单体结合阻断F肌动蛋白形成，调节细胞肌动蛋白骨架的动态变化，与细胞运动等功能密切相关[13]。早在1999年Yong等[11]发现Tβ4硫氧化物（thymosin sulfoxide）在体内体外均有很好的抗炎作用，能抑制中性粒细胞的趋化作用，减少炎症介质释放等。Badamchian等发现Tβ4能降低大剂量内毒素对大鼠的致死率，减少血液中IL1， PFG等多种炎症因子的含量，提示Tβ4具有抗内毒素休克作用[14]。Sosne等用不同的动物模型证实Tβ4具有抗炎促进角膜损伤修复的作用。我们的实验结果证实Tβ4可加速角膜碱烧伤后愈合，组织学观察显示角膜再上皮化明显，角膜各层组织结构清晰，减少角膜内炎症细胞浸润。
　　
　　角膜碱烧伤后启动一系列的炎症进程，释放大量的趋化因子诱导中性粒细胞、巨噬细胞等进入损伤区域，并且许多前炎性因子如TNFα， IL1β等释放增加，使损伤局部炎症失调，这是角膜碱烧伤后组织破坏严重难以愈合的原因之一。Sosne等研究Tβ4可以降低角膜碱烧伤后MIP和MCP， KC等趋化因子表达，减少PMN浸润，减轻修复过程中过度的炎症反应，促进角膜愈合[3]。TNFα和IL1β等前炎症因子能激活多种信号通路而在调节组织炎症过程中起关键作用[2]。NFκB是TNFα和IL1β等激活的重要的转录因子，调节许多炎症相关细胞因子的转录表达。早期研究使用NFκB特异性抑制剂能减轻组织炎症损伤，促进角膜碱烧伤愈合[12]。Sosne等[6]研究Tβ4在体外对角膜碱烧伤后NFκB的作用，发现NFκB的活性被降低，细胞核内p65蛋白的表达量降低，可能Tβ4是通过抑制NFκB来调节角膜炎症反应的程度。我们利用免疫组织化学染色观察角膜碱烧伤后NFκB的表达，发现NFκB在上皮基底层表达最多，基质层只在巨噬细胞和中性粒细胞周围有表达，内皮全层阳性，统计平均光密度发现在7d和14d在Tβ4低剂量组（P&<0.01）和中剂量组(P&<0.05)比对照组低。因为NFκB激活后必须转位到细胞核内才能发挥其转录活性，我们抽提了角膜组织细胞核蛋白，利用ELISA定量分析p65亚基的表达，发现在3，7和14d时细胞核内的NFκB p65亚基表达比阴性对照和阳性对照组低（P&<0.01），说明Tβ4抑制细胞核内有效NFκB的表达量。与免疫组化染色结果比较，发现NFκB表达降低的时间点提前（免疫组化在7d才发现降低），可能因为免疫组化显示全细胞内NFκB的表达，而ELISA结果仅显示细胞核内NFκB的表达。以上结果显示Tβ4可抑制NFκB表达并阻止其向细胞内转移，为了显示这种抑制作用是否发生在激活NFκB的上游通路，我们用免疫组化检测一种重要前炎症因子IL1β的变化，发现在各个时间点Tβ4用药组与对照组无差异（P&>0.05）。提示Tβ4可能对前炎症因子表达无调节作用，对NFκB的抑制作用是在NFκB的激活和核转位的过程中。现已证明，Tβ4可通过多种途径促进损伤组织修复，随着相关作用机制不断被揭示和阐明，它有望成为促进角膜创伤愈合，尤其是糖尿病视网膜病变、角膜溃疡和角膜手术后创伤愈合的新的治疗药物。

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