双自杀基因CDTK载体系统对人视网膜母细胞瘤Y79细胞体外杀伤作用的研究

【摘要】 目的：研究肿瘤特异性双自杀基因载体pcChCDTK对人视网膜母细胞瘤Y79细胞的体外杀伤作用。方法：将双自杀基因载体pcChCDTK电转染Y79细胞株。通过RTPCR和 Western blot方法确定CDTK在体外培养的细胞中表达情况。用HPLC法测定转染Y79细胞中5FC向5FU的转化效率。向载体转染和未转染的Y79细胞中加入不同浓度的前体药物5FC(0，25，50，100，200，400，800mg/L)和/或GCV(0，2，4，8，16，32，64mg/L)，5d后用MTT法检测Y79细胞的平均存活率。结果：双自杀基因载体pcChCDTK电转染Y79细胞成功：在载体转染的Y79细胞中，RTPCR扩增出长度为403bp的特异条带，Western blot检测见一59kD大小的条带，与CDTK基因序列分析的预期结果一致。双自杀基因载体系统致Y79细胞存活率降低：转染Y79细胞中，5FC向5FU转化的效率为84.5%。转染和未转染Y79细胞中加入5FC或GCV后平均细胞存活率均随浓度增加而降低，两组比较当5FC浓度达到100mg/L，GCV浓度达到8mg/L后各对应浓度组间均存在差异(P&<0.05)。转染组间比较，当5FC达200mg/L，GCV达16mg/L后，5FC+GCV组平均细胞存活率低于单加5FC或GCV组，有统计学差异(P&<0.05)。结论：双自杀基因载体pcChCDTK转染Y79细胞后，在Y79细胞被转录和翻译成CDTK双自杀基因蛋白。给予5FC和GCV达到一定浓度时，它们转化成细胞毒性物质对Y79细胞产生杀伤作用。双前体药物的杀伤作用大于单前体药物。

【关键词】 CDTK基因;视网膜母细胞瘤;自杀基因治疗;5FC;GCV

　　Abstract

　　AIM: To investigate the killing effects of tumor cells specific vector of suicide gene of CDglyTK driven by hTERT promoter on retinoblastoma Y79 cells in vitro.

　　METHODS:At first，the recombinant plasmid was transfered into Y79 cells with electroblot as a delivery system. RTPCR and Western blot analysis were used to determine the CDTK mRNA and protein expression in Y79 cells which had been transfected by pcDNA3.1CMV hTERT CDTK plasmid vector. The conversion efficiency of 5FC into 5FU in CDglyTKexpressing Y79 cells was measured by HPLC. The killing effects of double suicide genes on Y79 cells that treated with 5FC，GCV of different concentrations were determined by the method of MTT.

　　RESULTS:The expression of CDTK gene in Y79 cells was certificated by RTPCR and Western blot and a 59kD protein was obtaind which was equal to the sequence expection of CDTK gene. In MTT analysis，there was significant difference between transfected and nontransfected survival Y79 cells(P&<0.05).The survival Y79 cells treated with 5FC and GCV was lower than 5FC or GCV.

　　CONCLUSION:The recombinant plasmid vector pcDNA3.1CMV hTERT CDTK can be transcribed and translated into CDTK fusion protein in Y79 cells.The transfer of the CDglyTK fusion gene into Y79 cells followed by the administration of 5FC or GCV can kill Y79 cells in vitro. The killing effect of two predrugs is stronger than that of one predrug.

　　KEYWORDS: CDglyTK gene; retinoblastoma;suicide gene therapy;5FC; GCV

自杀基因治疗是近年来肿瘤研究的热点领域之一，也是目前最有可能有效应用于临床的肿瘤基因治疗策略之一。构建安全高效的载体是基因治疗的关键。我们已经成功的构建了含有hTERT启动子的肿瘤特异性杀伤载体pcChCDTK[1]。我们将探讨该载体对人视网膜母细胞瘤Y79细胞在体外的作用。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　Y79细胞株[美国模式菌种收集中心(ATCC)];RPMI1640细胞培养基(Gibco);胎牛血清(Gibco);5FC，5FU，GCV(Sigma);Reverse Transcription system kit(Invitrogen);Trizol(Gibco); QIAfilterTM plasmid Maxi kit(Qiagen); Triton X100(CalBiochem); ECL试剂盒(Amersham pharmacia biotech); PVDF膜(Amersham pharmacia biotech);双丙烯酰胺(BioRad); MTT(Sigma);鼠TK mAb(QED公司);兔抗鼠IgG二抗(KPL公司);蛋白质Marker(上海生化试剂公司);实验所用引物 (上海生工生物工程有限公司)：yCDrt：5’ACGCTGTGTTGTCGGTGAGAA3’;TKrt：5’CAC CACCACGCAACTGCTG3’;βactin F：5’CACCCTGAAGTA CCCCATCG3’;βactin R：5’TTGCCAATGGTGATGACCTG3’。

　　1.2方法

　　将经过证实的含有pcChCDTK质粒的JM109菌液0.2mL接种到200mL含50mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，280r/min的摇床上培养16h，将菌液转移到离心瓶中。然后按照QIAfilterTMplasmid Maxi kit提供的步骤进行操作提取质粒pcChCDTK，干燥后，加无菌水溶解质粒300μL，用Duc 640分光光度计测定DNA含量，20℃分装保存。用RPMI1640培养液培养Y79细胞，每日在倒置相差显微镜下观察。Y79细胞悬浮生长，培养中细胞可聚集成团并沉集于培养瓶底部，当细胞基本铺满瓶底即可传代，按照1∶2～1∶4传代。将传代后的Y79细胞培养24h后，细胞进入对数生长期，即可用于电转化。未转染Y79细胞生长迅速，传代后培养24h后，细胞进入对数生长期。取上述进入对数生长期并基本铺满瓶底的细胞，在22℃，1000r/min的条件下，离心10min，收集细胞。用0.01mol/L PBS 10mL重悬细胞，取细胞悬液20μL，用细胞计数板计数，其余细胞在22℃，1000r/min条件下，离心10min，重新收集细胞;根据计数结果，用0.01mol/L PBS以6.25×109/L的密度重悬细胞。取800μL细胞重悬液加入到含有pcChCDTK质粒20μg的EP中，吹打混匀，然后转入0.4cm的电击杯中，以2kV，25μF的条件进行电击。电击后，迅速将电击产物分至已加入10mL 200mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液的75cm2培养瓶中，置37℃，50mL/L CO2的细胞培养箱内培养。电转染后的Y79细胞生长与未转染细胞相似。倒置相差显微镜下见细胞悬浮生长，形状饱满，色泽鲜亮，聚集成团。

　　1.2.1 CDTK基因表达的检测

　　提取Y79细胞RNA;参照reverse transcription system kit进行RTPCR反应;取逆转录产物2μL作为模板，以yCDrt和TKrt为引物扩增CDTK，同时用βactin扩增引物作对照，RTPCR产物用8g/L琼脂糖凝胶跑胶检测。另取未转染的Y79细胞设为对照，同法处理。取转染48h和未转染的Y79细胞预处理;固定玻片;配制分离胶和堆积胶;上样;跑胶;转膜;封闭;加一抗;洗一抗;加二抗;洗二抗;显色;曝光。

　　1.2.2 5FU浓度的检测

　　人视网膜母细胞瘤细胞株Y79用含200mL/L胎牛血清RPMI1640培养液在37℃，50mL/L CO2细胞培养箱中正常培养。细胞在转染肿瘤特异性杀伤载体pcChCDTK前24h换液，调整细胞密度使之在转染时达基本铺满瓶底。将细胞在22℃，1000r/min的条件下，离心10min，收集细胞，用适当体积的无血清的RPMl1640培养液重悬，细胞计数，使之密度为6.25×109/L。取细胞悬液800μL加入自杀基因载体pcChCDTK 20μg，将其混匀，转入0.4cm的电击杯中，以2kV，25μF的条件进行电击。电击后，细胞接种入培养瓶中培养，24h后收集细胞并用1×PBS洗3次，然后用含200mL/L胎牛血清的RPMl1604培养液配成细胞悬液，以每孔2×105个细胞的浓度植入24孔板，每孔培养液体积1mL。24h后加入前体药物5FC(200mg/L)。在加5FC 24h后取其细胞上清，用高效液相色谱仪(HPLC)检测其5FU的浓度。配5FC及5FU标准品的浓度梯度做标准曲线。LC10A高效液相色谱仪;分析柱: Shimpack CLCODS(5μm，150mm×4.6mm，ID);预柱YWGODS(10μm，10mm×4.6mm，ID);流动相：甲醇/水(20/80);流速1mL/min;检测波长266nm;柱温37℃。10μL进样。

　　1.2.3前体药物对细胞毒性的检测

　　采用Western Blot技术检测新融合自杀基因CDTK在视网膜母细胞瘤Y79细胞中的蛋白质水平表达。人视网膜母细胞瘤细胞株Y79用含200mL/L胎牛血清RPMI1640培养液在37℃，50mL/L CO2细胞培养箱中正常培养。以2×105个细胞的密度将细胞接种到96孔板中培养，每孔体积200μL。24h后，加入不同浓度的前体药物100μL，即5FC以0，25，50，100，200，400，800mg/L;GCV以0，2，4，8，16，32，64mg/L加入96孔板。每个浓度梯度有4孔。留1孔不加细胞，只加培养液做空白对照孔。在37℃，50mL/L CO2的条件下，细胞不换液培养5d后，每孔加入(5g/L) MTT溶液20μL，37℃，继续孵育4h，终止培养，吸去培养上清液。每孔加入DMSO 150μL，振荡10min，使结晶物充分溶解。比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上调定各孔吸收值。以每天进行换液的细胞做对照，假设细胞存活率为100%，将其它各细胞孔的吸收值与其比较得出各处理组细胞的平均存活率。另视网膜母细胞瘤细胞在转染前24h换液，调整细胞密度使之在转染时达基本铺满培养瓶底。将pcChCDTK载体电转染Y79细胞。电击后，细胞接种入培养瓶中培养，24h后，收集细胞并用0.01mol/L PBS洗3次，然后用含200mL/L胎牛血清的RPMl1604培养液配成细胞悬液，以每孔2×105个的密度植入96孔板中培养，每孔体积200μL。24h后加入不同浓度的前体药物100μL，5FC+GCV以两药的对应浓度加入96孔板，每个浓度梯度有4孔。留一孔不加细胞，只加培养液做空白对照孔。然后用MTT法检测细胞存活率。统计学分析：所得数据用SPSS 11.5统计软件包进行统计，采用StudentNeuman Keuls(SNK)检验，以P&<0.05为统计学上具有显著性差异。

　　2结果

　　2.1 Y79细胞转染后CDTK基因的表达

　　RTPCR检测结果显示，转染组可见一403bp特异条带，与预期大小一致(图1)。而在未转染的对照组细胞中，未扩增出403bp特异条带。在两组中均扩增出作为内对照的βactin产物561bp条带。分析结果显示：大小为42kD的内参βactin蛋白条带在转染和未转染的Y79细胞中均可见，一个大小为59kD的条带，在转染了pcChCDTK载体的Y79细胞中可见，这与yCDTK基因序列分析的预期蛋白大小一致，为自杀基因yCDTK蛋白。未转染pcChCDTK的Y79细胞中则没有59kD的条带出现(图2)。

　　2.2 Y79细胞转染后5

　　FC转化效率 加5FC 24h后上清中5FU的浓度平均含量为169mg/L，5FC向5FU的转化效率约为84.5%。

　　2.3前体药物对Y79细胞的毒性

　　将生长良好的人视网膜母细胞瘤Y79细胞，按每孔2×105个细胞接种到96孔板中培养。加入不同浓度的前体药物5FC培养5d，平均细胞存活率分别为98.2%，94.7%，90.5%，88.2%，89.4%，86.4%和83.9%。SNK检验表明，各梯度间的细胞存活率存在显著性差异(P&<0.05)，表明5FC对Y79细胞有低微毒性。加入不同浓度的前体药物GCV培养5d后，平均细胞存活率分别为96.2%，95.2%，93.5%，93.3%，83.4%，68.9%和59.9%。SNK统计分析表明后3个数据与前4个数据有显著性差异(P&<0.05)，表明高浓度的GCV对Y79细胞有较强的毒性作用，浓度越高毒性越大。

　　2.4前体药物对用肿瘤杀伤载体转染的人视网膜母细胞瘤细胞的毒性检测

　　将电转了pcChCDTK的人视网膜母细胞瘤细胞，按相同的密度将细胞接种到96孔板中培养。加入不同浓度的前体药物5FC培养5d，平均细胞存活率分别为94.0%，91.6%，85.1%，80.0%，72.7%，69.9%和62.7%。SNK检验表明，各梯度间的细胞存活率存在显著性差异(P&<0.05)，与未转染的细胞对应浓度组比较，当5FC浓度达到100mg/L后各对应浓度组间均存在差异(P&<0.05)。当加入不同浓度的前体药物GCV培养5d后，平均细胞存活率分别为94.7%，90.3%，87.6%，82.9%，68.6%，57.6%和55.9%。SNK统计分析表明后3个数据与前4个数据有极显著性差异(P&<0.05)，与未转染的细胞对应浓度组比较，当GCV浓度达到8μg/mL各对应浓度组间均存在差异(P&<0.05)。加入不同浓度的双前体药物5FC+GCV培养5d后，平均细胞存活率分别为94.6%，89.2%，84.2%，81.0%，66.3%，56.4%和53.5%。统计分析表明各梯度间的细胞存活率存在显著性差异(P&<0.05)。5FC，GCV与5FC+GCV组间采用SNK多重比较，当5FC达200mg/L，GCV达16 mg/L后，三组间平均细胞存活率均有统计学差异(P&<0.05)，细胞存活率大小为：5FC&>GCV&>5FC+GCV。

　　3讨论

　　目前，相对于传统的视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)治疗方法而言，RB基因治疗不仅可以弥补光凝固治疗、光动力学治疗、温热治疗、冷冻治疗的应用局限性，而且不会产生诸如化学治疗、放射治疗的副作用，更不会因为眼球摘除所导致的致残性而造成患儿心理障碍影响生图1RTPCR产物凝胶电泳图 M:DL2000 Marker;1:转染组可见预期的CDTK(403bp)目的片段和βactin(561bp);2:未转染组;3:阴性对照。图2Western Blot检测CDTK的表达 A：1，2:βactin(42kD);B：1:转染pcChCDTK的Y79细胞，出现一条约59kD蛋白;2:未转染的Y79细胞。

　　存质量。因此，RB基因治疗的研究越来越为人们所重视，并且通过不同的治疗策略取得了一系列的研究进展。现阶段对RB基因治疗的研究主要集中在4种不同的基因上，包括自杀基因、抑癌基因、抗血管生成基因以及促凋亡基因。RB发生的分子机制还不是太清楚，而且与RB形成相关的抑癌基因凋亡诱导基因种类繁多，与肿瘤血管形成相关的诱导因子和抑制因子多种多样，且分子机制仍有待于进一步研究。我们选择双自杀基因CDTK作为目的基因，实施RB的自杀基因治疗。首先，自杀基因作为肿瘤基因治疗的候选基因，已经在多种肿瘤开展研究[27]。其表达产物和前体药物相互作用来实现肿瘤基因治疗的机制比较清楚。其次，自杀基因和前体药物相互作用产生的毒性物质能通过不同方式实现对邻近肿瘤细胞的旁杀效应，包括直接分泌到细胞外旁杀，或通过细胞间隙连接旁杀，或通过产生凋亡小体、免疫介导来实现旁杀。同时，目前的研究表明，自杀基因系统治疗RB是安全有效的[8]。我们设计的含有双自杀基因CDTK的载体通过电转染的方式导入了视网膜母细胞瘤细胞株Y79细胞。48h后，提取转染Y79细胞RNA，RTPCR的结果可见一403bp特异条带，与预期大小一致，显示双自杀基因CDTK在细胞中mRNA水平得到了表达。Western blot的结果也同样显示，载体转染的Y79细胞中，59kD的目的基因蛋白有明显的表达。这两个实验结果充分说明，我们构建的双自杀基因CDTK在靶细胞Y79中得到表达。先前的研究显示，被设计得的融合基因yCD/UPRT、大肠杆菌CDglyTK以及yCDglyTK具有最强的催化前体药物向细胞毒物转化的能力。我们通过HPLC检测5FU的浓度，上清中5FU的浓度平均含量为169mg/L，故5FC向5FU的转化效率约为84.5%，说明我们所构建的肿瘤特异性双自杀基因载体具有很强的催化前体药物向细胞毒性物质转化的能力。

　　双自杀基因疗法是将两种自杀基因整合在一起，通过载体转导进入肿瘤细胞，其在肿瘤细胞内表达的融合基因产物具备两种酶的活性。因此，双自杀基因疗法可以大大提高抑制肿瘤生长的功效，同时使得前体药物的用量减半。大量资料表明双前体药物对肿瘤细胞的杀伤作用要强于单前体药物。但也有资料显示双自杀基因之间可能存在拮抗效应。在体外实验中，单独加5FC的细胞杀伤最强，要高于5FC和GCV都加的组，而单独加GCV的细胞杀伤力最低， CD和TK之间没有协同作用，反而可能会相互干扰各自功能的运行。原因可能有两个方面：(1)可能是融合基因yCDglyTK在同时加5FC和GCV时，CD/5FC和TK/GCV两种系统的功能出现拮抗效应;(2)可能是在yCDglyTK融合基因中，由于某种原因，CD和TK的活性在这个融合基因中得到提高，使CD/5FC和TK/GCV两种系统的抑瘤能力同时或其中一种得到增强。当E.coli CD和HSV1 TK基因同时在一种细胞中表达时，会存在相互干扰作用。这种干扰作用的机制到目前还没搞清楚，但干扰作用可能不是发生在基因的转录期，而是在转录之后，TK介导的5FUMP的磷酸化会产生无毒的5FdUDP和5FdUTP，而不是毒性产物5FUDP和5FUTP，从而减低了CD/5FC的细胞毒性作用;或者CD介导的对GCV，ACV等的脱胺反应减低了TK/GCV系统的细胞毒性。yCD/UPRT基因中UPRT的酶活性与单独的UPRT酶活性大致相等，但是yCD/UPRT基因中的CD酶活性要高于单独CD酶活性100倍。这种酶活性的改变可能与这3种酶的蛋白质特性不同有关。加入不同浓度的前体药物5FC，GCV或5FC+GCV于电转了pcChCDTK的人视网膜母细胞瘤Y79细胞培养5d， SNK检验表明，与未转染的细胞对应浓度组比较，当5FC浓度达到100mg/L后各对应浓度平均细胞存活率组间均存在差异(P&<0.05);与未转染的细胞对应浓度组比较，当GCV浓度达到8mg/L各对应浓度平均细胞存活率组间均存在差异(P&<0.05);转染组间比较，当5FC达200mg/L，GCV达16mg/L后，3组间平均细胞存活率均有统计学差异(P&<0.05)，细胞存活率大小为：5FC&>GCV&>5FC+GCV，既对双自杀基因转染的Y79细胞的杀伤作用大小顺序为：5FC+GCV &>GCV &>5FC。在本实验中，单前体药物对双自杀基因CDTK载体转染的Y79细胞均有杀伤作用，但双前体药物的杀伤作用要强于单前体药物。分析产生这种结果的原因，我们认为：(1)双自杀基因载体具有很强的催化前体药物向细胞毒物转化的能力;(2)这可能与我们加入的CMV增强子能大大促进hTERT启动子启动下游目的基因的表达有关，因为CMV增强子具有强大的增强转录能力，且没有组织特异性。

参考文献

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