作者：张平 焦运 袁迎春 刘娅 张栩 李玉芳 丁向春
【摘要】 目的 分析HBV感染者外周血各亚群淋巴细胞的变化。方法 对112例乙肝患者采用荧光定量PCR技术和流式细胞术分别检测血中HBV-DNA及检测各组外周血T细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+、CD3-/CD16+CD56+(NK细胞)、CD3-CD19+(B细胞)表达百分比。结果 与急性肝炎组比较，慢性肝炎、肝硬化组CD3、CD4、CD8均有下降(P&<0.05)，肝硬化组下降最明显。而肝硬化组B细胞百分比较慢性肝炎、急性肝炎组高(P&<0.05)，NK细胞百分比较慢性肝炎、急性肝炎降低(P&<0.01)。结论 HBV感染者体内存在T细胞亚群失衡和细胞免疫功能紊乱，外周血T细胞亚群随病情进展而减少，主要为CD3、CD4、CD8。
【关键词】 乙肝病毒;T淋巴细胞亚群;急性肝炎;慢性肝炎
乙型肝炎的病变由HBV感染诱发的免疫病理反应造成。为探讨乙型肝炎发生发展过程中免疫功能变化特点，本研究采用荧光定量PCR技术对112例乙肝患者血清中HBV-DNA的感染情况进行检测，同时对其外周血T细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+、CD3-/CD16+CD56+(NK细胞)、CD3-CD19+(B细胞)进行分析，探讨HBV感染者的细胞免疫状态及其与病毒复制的关系。
1 材料与方法
1.1 病例选择 我院2008年1—6月收治的住院患者112例，男79，女33例，年龄15～65岁，平均(31±22)岁。病程6～106个月。诊断符合西安会议修订的《病毒性肝炎防治方案》诊断标准[1]，其中慢性乙型肝炎(CAH)57例，乙型肝炎肝硬化(LC)36例，急性乙肝(AHB)19例，均排除甲、丙、丁、戊型肝炎。入院前3个月内无免疫制剂史。
1.2 主要试剂和仪器 北京医用离心机厂低速离心机，日本日立公司SANYO型低温冰箱，Ficoll淋巴细胞分离液(比重1.077±0.002)购自上海试剂二厂，TagDNA聚合酶购自晶美生物制品公司，荧光定量试剂盒购自深圳达安基因公司，淋巴细胞亚群单抗试剂：simultestTM IMK-Lymphocyte购自BD公司，FACS Calibur流式细胞仪购自Beckman coulter公司。
1.3 流式细胞仪测定淋巴细胞亚群百分比
将含EDTA2Na空腹全血3mL，在采集后4h通过simultestTM IMK-Lymphocyte试剂盒、FACScalibur流式细胞仪分析淋巴细胞亚群，包括CD3+、CD4+、CD8+、NK、B细胞表达百分比，最后进行各淋巴细胞亚群百分比统计学分析。
1.4 血清HBV-DNA检测 参照试剂盒说明书进行。直接吸取血清50μL，加等量的DNA提取液混匀，100℃沸水浴10min，转至4℃静置6～8h，离心5min，取上清液5μL做PCR反应。
1.5 统计学方法 数据以均数±标准差(±s)表示，两组间样本均数比较采用Student`s t检验，组间的两两比较采用Student-Newman-Keuls。
2 结果
2.1 各组外周血淋巴细胞亚群检测结果 见表1。
2.2 血清HBVDNA(+)与HBVDNA(-)组的CD3、CD4、CD8、NK、B细胞比较 见表2，两组差异无统计学意义P&>0.05。表1 各组外周血淋巴细胞亚群检测结果比较
3 讨论
HBV感染人体后可引起肝脏和其他脏器的病变。乙型肝炎的发生是机体与病毒相互作用的结果。HBV侵入肝细胞内增殖，可使受染细胞表达HBsAg、HbcAg等，能为机体免疫系统所识别，引起一系列的免疫应答。人体外周T淋巴细胞由不同的亚群组成，T淋巴细胞是宿主抗病毒、抗肿瘤免疫反应中起主导作用的免疫活性细胞，构成了免疫系统的主要部分。
T淋巴细胞由不同的亚群组成。人成熟T细胞按表型不同可将其分为CD4+T细胞和CD8+T细胞。CD3+代表总T淋巴细胞，CD4+T细胞为辅助性T细胞，CD8+T细胞为细胞毒性T细胞。本研究通过流式细胞仪测定发现，随着病情发展从急性肝炎组到慢性肝炎、肝硬化组CD3+、CD4+、CD8+、NK细胞均有所下降(P&<0.05)，肝硬化组下降最显著，与有关报道一致[2]。而CD3+细胞数量的明显下降，说明机体参加细胞免疫反应的免疫活性细胞不足。已有研究表明随着病情的进展和延续，HBV患者的CD4+细胞不断受到破坏，但CD4+细胞损害的机制未明，可能与HBV持续感染病毒诱导的T细胞活化凋亡和T细胞增殖不足有关[3]。此外CD4+细胞还可直接溶解感染的肝细胞或通过产生细胞因子而间接清除HBV，它可能是HBV慢性化的机制之一[4]。慢性乙型肝炎患者CD4+细胞的数量和功能下降直接导致细胞免疫功能低下。CD8+细胞毒性T细胞对清除感染肝细胞的HBV有重要作用，CD8+T细胞是决定HBV清除状态的关键细胞亚群，通过细胞溶解或非溶解机制是CD8+T细胞清除机体感染HBV的主要方式[5]。
NK细胞是机体天然免疫的主要承担者。本组实验结果显示在HBV感染中肝硬化患者的NK细胞均低于慢性肝炎及急性肝炎组(P&<0.01)，说明HBV感染转归中NK细胞的减少可能与HBV慢性化相关[6]。本研究发现肝硬化患者外周血B淋巴细胞的百分比较慢性肝炎、急性肝炎组升高(P&<0.05、P&<0.01)，与冯慧棼报道一致[7]，可能与肝硬化患者自身抗体成分和球蛋白增加有关。本文中HBVDNA(+)患者与HBVDNA(-)患者外周血T亚群细胞数比值变化差异无统计学意义，提示T亚群细胞数与病毒复制程度无明显关系。
乙型肝炎细胞损伤和炎症反应是由宿主免疫应答和病毒共同作用的结果。HBV的慢性感染使机体的免疫系统发生明显的异常。T淋巴细胞是人体主要的免疫细胞，其数量和比例是反映机体免疫水平的主要指标。淋巴细胞计数与乙肝临床分型有一定关系。本文结果表明检测CD3+、CD4+、CD8+、NK、B细胞对了解肝病发病机制及肝脏损害程度有重要临床意义。
参考文献
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