【摘要】 目的 建立一种新的在线柱前衍生化HPLC-FLD法测定血浆中的阿米卡星。方法 血浆样品碱化后用乙腈沉淀蛋白，上清液用OPA程序在线衍生化后进样分析。色谱柱：Agilent XDB-C18(5μm，4.6mm×150mm);流动相：甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钠(70∶30，pH=3.67) ;荧光检测：λex=342nm，λem=440nm;流速：1.0mL/min;柱温：40℃;样品盘温度10℃;进样量：10μL;衍生化时间：1min。结果 该法测定血浆中阿米卡星定量下限为1 mg/L，线性范围在1～50 mg/L (r=0.9993);日内、日间RSD小于11%，绝对回收率大于90%，相对回收率大于95%。结论 本法准确、灵敏、易于操作，可用于阿米卡星的血药浓度测定及药动学研究。
【关键词】 硫酸阿米卡星;在线柱前衍生化;高效液相荧光检测法;血浆药物浓度
硫酸阿米卡星(Amikacin)为半合成氨基糖苷类抗生素，对大多数氨基糖苷类钝化酶稳定，适合于治疗革兰阴性杆菌中卡那霉素、庆大霉素或妥布霉素耐药菌株所致感染。对多数肠杆菌科细菌具有良好作用，对铜绿假单胞菌具有高效，而且与其它抗生素无交叉耐药性，抗菌作用比卡那霉素强。但是阿米卡星有肾毒性、听觉器官毒性和神经肌肉阻滞等毒副作用，在临床使用时，最好根据其体内血药浓度数据个体化给药，因此建立检测阿米卡星血药浓度的方法十分必要。由于阿米卡星化学结构没有强紫外吸收基团，并且血浆中阿米卡星浓度极低， 紫外检测器难以检测。本实验参考有关文献[1-5]，建立在线柱前衍生化HPLC荧光检测方法，以测定人血浆中阿米卡星的浓度。
1 材料
美国Agilent1200型高效液相色谱仪(自动进样器，四元梯度泵，可控柱温箱，荧光检测器，Chemistations化学工作站)，pHS-3B型精密pH计(上海雷磁仪器厂)，TGL-20M台式高速冷冻离心机(湖南赛特湘仪)，梅特勒十万分之一电子分析天平(瑞士Mettler公司)，XH-B漩涡混合器(姜堰市康健医疗器具有限公司)。
阿米卡星对照品(中国药品生物制品检定所，批号：130335-200204);邻苯二甲醛(o-Phthalaldehyde， OPA)，Sigma公司生产，批号：2114022;甲醇、乙腈均为色谱纯，其余试剂均为分析纯;水为纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司);空白血浆(购于本院输血科)。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Zorbax EcliPse XDB-C18(5μm，4.6mm×150mm);保护柱:Agilent Zorbax SB-C18(5μm，12.5mm×4.6mm);流动相：甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钠(pH=3.67)，70∶30;荧光检测：激发波长342nm，发射波长440nm;流速：1.0 mL/min;柱温：40℃;样品盘温度10℃;进样量：10μL;衍生化时间：1min。
2.2 柱前程序衍生 自动进样器样品盘编号：1为OPA衍生化试剂，2为色谱纯乙腈(未加盖)，3为纯水(未加盖);进样顺序：从样品盘中吸取经碱化乙腈沉淀蛋白后20μL血浆样品，从2中吸取0.0μL乙腈，从1中吸取20μL OPA硼酸盐溶液，从3中吸取0.0μL纯水，空气中最大混合速度混合5次，等待1min后进样。
2.3 对照品溶液和衍生化试剂的配制 精密称取阿米卡星对照品10.0mg，至10mL棕色容量瓶中，用纯化水溶解并定容至刻度，置冰箱4℃贮存备用。精密称取OPA 400mg溶于8mL甲醇中，再加8mL α-巯基乙醇，用pH=10.4、0.4 mol/L的硼酸缓冲液定容至100mL棕色容量瓶，临用前用0.22μm滤膜过滤，取滤液置自动进样器供衍生化。
2.4 血浆样品衍生化前处理 精密量取血浆样品200μL于离心试管中，加入pH=10.38硼酸缓冲液200μL，漩涡混合后，加入乙腈400μL，旋涡振荡1min， 12000 r/min离心10min，吸取上清液200μL置自动进样器衍生化。
2.5 标准曲线的绘制 配制阿米卡星血浆浓度为1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 mg/L，按“2.4项”下进行，然后置自动进样器按“2.3项”下所述方法操作，进行色谱分析，以浓度为横坐标，衍生化产物的峰面积为纵坐标做回归曲线，得方程：Y=89.489X-16.804，(r=0.9993，n=6)，在1.0～50 mg/L浓度范围内呈良好的线性关系，定量下限为1.0 mg/L。
2.6 回收率与精密度试验 分别配制浓度为2.0、10.0、50.0 mg/L阿米卡星血浆样品，按“2.4项”下处理，然后置自动进样器按“2.4项”下所述方法操作，按回归方程计算实测浓度，分别在同一天内测定5次，连续3d，结果见表1。表1 阿米卡星衍生产物的回收率和精密度
2.7 检测波长的选择 精密移取一定浓度阿米卡星对照品溶液，按“2.2项”下进行，经衍生化后，进样，三维荧光光谱扫描，见图1所示(见封3)。激发光谱与发射光谱与文献报道一致[6]。
2.8 专属性考察 用血浆配制一定浓度的阿米卡星，按上述方法进行衍生化后进样，衍生化产物保留时间约为5.3min;另取空白血浆同法进行处理后进样以及OPA单独进样。考察衍生化试剂、内源性物质是否经OPA衍生化后对阿米卡星衍生化产物有干扰，结果见图2(见封3)。未见OPA、空白血浆对衍生产物有干扰色谱峰存在。
2.9 稳定性试验 将一定量的阿米卡星加入空白血浆中，制成2.0、10.0、50 mg/L的血浆样品各5mL，置于-20℃下，分别于配制当天、1d、10d后解冻，按2.4项操作后，再按2.2项处理，测得血浆反复冻融稳定性的RSD小于15%。表明样品在低温条件下保存10d稳定。
2.10 患者血样分析 6名肝肾功能正常成年患者静脉滴注硫酸阿米卡星0.4～0.8g，每日1次或2次，滴注时间0.5～1.0h。滴注前和滴注结束采集血样，分离血浆，按本法进行血浆药物浓度测定。结果谷浓度为(7.2±2.3) mg/L，峰浓度为(20.8±7.6) mg/L。
3 讨论
阿米卡星是卡那霉素A的C-1氨基上引入α-羟基-γ-氨基丁酸得到的，且没有紫外吸收基团。在2-巯基乙醇存在、PH为 9～11的条件下，伯胺基化合物作为亲核试剂与OPA反应生成1-硫代-2-烷基异吲哚，试剂过量2或3个数量级的条件下数秒内完成，且过量的衍生化试剂不影响测定结果。由于OPA衍生化产物的信号衰减很快，本法采用柱前在线衍生化。
参考有关文献[7]，当血浆与乙腈体积比为1：2时，即能去除95%以上血浆中的蛋白质。笔者在实验过程中，分别用甲醇和乙腈作为蛋白沉淀剂，结果表明甲醇蛋白沉淀率比同体积乙腈低，故本法采用乙腈作为蛋白沉淀剂。
有各种因素影响衍生化反应，如温度、pH值、衍生化试剂的浓度、衍生化反应时间等，所以对实验条件要严格控制。由于本试验是在线衍生化后直接进样，反应为放热反应，故设定样品盘温度为10℃。
参考文献
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[6] 马春华，陈培珍.荧光分光光度法测定丁胺卡那霉素含量[J].武夷学院学报，2008，27(5)：32-34.