【关键词】 肺缺血再灌注;凋亡
缺血再灌注(Ischaemia-reperfusion，IR)导致的肺损伤是心肺手术，尤其是肺移植术中的一大临床难题，而随着心肺旁路的应用，术后肺功能障碍更是常见，甚至于患者术后由此而导致生命危险。早期研究多关注于肺组织细胞坏死所造成的损伤，直至最近肺缺血再灌注损伤(Lung Ischaemia-reperfusion Injury，LIRI)引起的细胞凋亡机制才逐渐被人们所重视。凋亡过程是多基因严格控制的过程，如Bcl-2家族、Caspase家族、癌基因如C-myc、抑癌基因P53等。现对近年来LIRI时细胞凋亡的病理机制及Bcl-2、Bax、caspase-3等调控基因在其中的作用作一综述。
1 凋亡与肺缺血再灌注损伤
在肺缺血再灌注损伤中除了直接的细胞坏死外，细胞凋亡也是细胞死亡的基本形式。在缺血阶段由于缺氧，坏死的细胞占据多数，而细胞凋亡则多发生在在再灌注阶段。Fischer等于再灌注后对移植肺进行病理活检，细胞凋亡数明显增加且与再灌注时间相关[1]。Stammberger认为严重的再灌注损伤在肺移植过程早期发生[2]。单纯缺血会引起肺细胞凋亡轻度增加，再灌注后2小时肺细胞凋亡数达到峰值。而Omasa等的发现继发于再灌注损伤的凋亡细胞数量与肺分流分数及细胞氧化损伤呈显著相关[3]。细胞凋亡过程中有一系列特征性的改变。其中最重要的就是凋亡细胞染色体基因组的片段化过程，即细胞凋亡发生时Ca2+、Mg2+离子依赖性核酸内切酶被激活，选择性降解染色体核小体间DNA，形成大小不一的DNA片段。细胞凋亡的DNA降解可以用不同的方法检测，如DNA琼脂糖凝胶电泳方法、酶联免疫技术和原位末端标记法等。原位末端标记(in situ end.1abeling，ISEL)是将掺入到凋亡细胞中的外源性核苷酸在酶(如末端脱氧核昔酸转移酶、DNA聚合酶I或Klenow大片段等)的催化下与凋亡细胞因内源性核苷酸酶的激活而产生的单股或双股断链相结合，再通过一定的显示方法使之显示出来。通常有两种方法：(1)末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记，简称TUNEL;(2)DNA聚合酶I或Klenow大片段介导的原位末端平移(in situ nick translation)，简称INST。这两种方法用于检测组织或培养细胞的凋亡细胞的核断裂片段，特异性和敏感性较高。而TUNEL鉴定的敏感性则要比INST相对更高一些。流式细胞仪检测凋亡细胞是近年发展的新技术。原理主要是根据细胞凋亡时细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。流式细胞术的敏感性和特异性都很高，但是对组织标本的凋亡的检测却并不适合。
2 凋亡相关基因在肺缺血再灌注中的作用
细胞凋亡是一系列连锁反应的过程，主要有两条信号分子通路：其一为受体介导的死亡信号通路，主要由外源性信号引起，通过特定的受体一配体相互作用，如：Fas/Fas-L、TNF-a相应受体等，激活外源性信号通路，导致细胞内凋亡级联相继激活，包括caspases(半胱氨酸天冬氨酰蛋白酶);另一条凋亡通路由线粒体介导的，主要由内源性信号所引起的，通过细胞色素C的释放激活caspase-9，引起caspases级联反应。另外线粒体内膜腔内还释放许多多肽，对凋亡起重要的调控作用，两条通路间存在一定的交叉。细胞周围环境中的生长因子(包括血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、巨噬细胞集落刺激因子)，能通过细胞内蛋白质酪氨酸激酶和蛋白质酪氨酸磷酸酶，影响肺上皮细胞凋亡。
2.1 外源性凋亡途径
目前认为Fas诱导的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(cycteinyl aspirate-specificprotease，caspase)途径是最重要的凋亡途径。Fas(CD95)是一种膜蛋白受体，分布于包括肺泡上皮细胞在内几乎所有细胞表面。相应的膜蛋白配体FasL(CD95L)属于TNF家族成员，与Fas受体结合后形成死亡诱导信号复合体(death-inducingsignal complex，DISC)，介导以caspase-8为主的凋亡反应，继而作用于下游的caspase-3、caspase-6、caspase-7，最终使细胞核内DNA断裂，促使凋亡发生。激活的caspase-3能裂解大量底物，包括抗凋亡成分及结构蛋白等诱导细胞凋亡，故号称死亡蛋白酶。Quadri SM等[4]在肺冷缺血期就发现有caspase-3、8、9的活化，移植后肺组织细胞凋亡明显增加，抑制caspase的活性，则凋亡明显减少，改善了移植后肺功能。caspase在凋亡的调节中有以下几个方面的作用：(1)结构分子去组装。(2)裂解抗凋亡蛋白Bcl-2，使其失去活性，同时裂解产物还可以促凋亡。(3)使DNA修复酶功能丧失。(4)识别PARP中的Asp-Glu-Val-Asp(DEVD)序列并切割，激活受PARP负调控的核酸内切酶的活性，最终使核小体间的DNA降解，出现形态学上的DNA梯带。(5)标记凋亡细胞以利于吞噬细胞吞噬。现已证明，在LIRI发展过程中抑制上述任何caspase通路都可减缓凋亡的发生。
此外，在临床研究中也观察到急性肺损伤(acute lung injury，ALI)或急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)患者的支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BAL)中存在较高水平的Fas及FasL，可能是来自肺组织内活化的中性粒细胞膜释放的可溶性Fas和FasL。同时，在急性肺损伤过程中产生的大量炎性因子能够抑制中性粒细胞的凋亡，进而间接促使其释放更多的FasL。Neff等[5]在肺缺血再灌注动物模型中发现在肺组织及肺动脉内皮细胞内可见增高的Fas和FasL表达，这种表达可被FasL抗体抑制。
2.2 内源性凋亡途径
内源性凋亡途径表现为线粒体依赖性，可被多种细胞应激所激活，最终导致线粒体通透性增加，破坏细胞内凋亡因子之间的平衡，从而诱导细胞的凋亡。例如，包括缺血再灌注在内的氧化应激可减少抗凋亡的线粒体蛋白(如Bcl-2和Bcl-x)的表达，并增加Bak、Bax、Bim等促凋亡蛋白的表达。蛋白水解裂解的Bid和Bax碎片通过与通透性转换孔复合体绑定可以增加线粒体的通透性，从而使线粒体内跨膜电位消耗，还使细胞色素c经线粒体外膜释放[6～7]。而且，Bax可能被钙蛋白切割为p18和p19Bax，它们可以为Bax和线粒体的相互反应提供正反馈[8]。细胞对死亡信号的敏感性取决于胞内Bcl-2/Bax竞争性的二聚体化过程。Bax二聚体形成便可诱导凋亡;随Bcl-2蛋白表达量的上升，越来越多的Bax二聚体分开，与Bcl-2形成比Bax/Bax更稳定的Bax/Bcl-2二聚体，拮抗了Bax/Bax诱导凋亡的作用，则细胞不发生凋亡。缺氧等凋亡诱导因素存在下，Bax蛋白从胞质中易位到线粒体外膜上形成蛋白转运孔，导致线粒体膜间腔内细胞色素C和凋亡诱导因子释放。自线粒体释放的细胞色素C和Apaf-1与caspase-9一起形成一种凋亡复合体激活caspase-3和后来与细胞凋亡相关的caspase级联式反应。有趣的是，在肺缺血再灌注中没有发现具有促凋亡作用的Bax的表达。
属于Bcl-2家族成员的Bcl-xL具有抗凋亡作用，它可以由通过抑制caspase的不同激活物诱导产生，Bcl-xL作用于Bid的下游，它的表达可以抑制由Bid激活诱导的凋亡变化，从而降低线粒体的损伤，减轻线粒体中细胞色素C地释放，并限制caspase-9地活化。Bcl-xL可以防止由氧化诱发的肺上皮细胞凋亡。而且，Bcl-xL可以防止Bax对线粒体膜产生作用[6]。缺血再灌注损伤可能是通过MAPK激酶3/p38MAPK途径降低抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的水平。Zhang等[9]发现在LIRI时Bcl-2以及Bcl-xL明显下调，且可能是通过P38-MAPK途径调节。Cooke等[10]用腺病毒转染人类Bcl-2在大鼠体内过表达后，可抑制肺移植后的细胞凋亡。而最近Carmen Peraha等[11]发现Bcl-2还能通过抑制趋化因子巨噬细胞炎性蛋白(macrophage inflammatory protein-2，MIP-2)的升高对肝IR后肺的损伤提供保护，提示Bcl-2是否还参与了对IR后炎症反应的抑制作用。凋亡蛋白地抑制和caspase途径的二次线粒体源催化剂在肺凋亡中也起重要作用[12]。但是，至今尚无研究专门探索这些途径在肺缺血再灌注诱导的凋亡中的作用。
2.3 有丝分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)途径
我们认为丝裂原活化蛋白激酶信号通路在细胞的增殖，分化和凋亡的调控中扮演重要角色。现在我们已经把丝裂原活化蛋白激酶的不同单元(包括p38和JNK等)通过细胞外激活物直接和间接激活的过程完整阐释了出来。MAPK超家族成员包括p38、c-jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase，ERK)等。p38丝裂原活化蛋白激酶是丝裂原活化蛋白激酶超家族的一员，它有α、β、γ三种亚型，它的作用与调控细胞的循环规律和存活的细胞膜到核信号转道路有关。p38丝裂原活化蛋白激酶可以在人体对代谢性应激、细胞因子和缺血的反应中由丝裂原活化蛋白激酶激酶3，4和6激活。在发生肺缺血再灌注损伤后，p38丝裂原活化蛋白激酶的活性水平同时受促凋亡(由促炎细胞因子和Bid分裂的产物引起)和抗凋亡活动的影响。
我们在对一例啮齿动物的肺缺血再灌注模型的研究中发现抑制p38MAPK的激活导致了再灌注发生后促炎细胞因子IL-1b水平下降，从而降低了肺泡损伤和肺水肿，还提高了氧分压。我们在对一例犬齿动物的肺移植研究中发现，移植后使用p38MAPK抑制剂，并将器官放入欧-科溶液(器官保养液)冷藏，氧饱和度极大提高，肺泡动脉氧压变化，肺血管耐受性和心输出得到改善，降低了肺水肿和中性粒细胞浸润[13]。肺再灌注头30分钟内心肺功能的提高与p38MAPK磷酸化后活性降低的水平是相一致的[13～14]。有趣的是，我们在研究同性和同种异体啮齿动物肺移植时发现，在肺再灌注2小时时p38MAPK的活性大幅降低，提示p38MAPK的活化可能还具有一定抗凋亡性质[14]。这些在促凋亡和抗凋亡特征上的矛盾可能是因为在不同的激活物影响下不同的MAPK激酶与不同的p38MAPK亚体结合而活化引起的。例如，MAPK激酶-3优先使p38-α和-γ激活，而MAPK 激酶-6激活p38-α，-β 和-γ。我们在对肺缺血再灌注损伤的动物模型研究中发现，被激活的亚体p38-αMAPK通过抑制caspase-3，-8和-9而表现出了抗凋亡作用。该作用可能是通过召集对细胞具有保护作用的血红素氧化激酶1基因而产生的。在肺缺血再灌注损伤后的凋亡现象中不同的p38MAPK和MAPK激酶亚体结合所产生的效果尚待进一步阐释。
MAPK家族的另一个成员JNK与应激诱导型凋亡有关。特别是在发生再灌注后氧化应激的情况下可能会诱导中性鞘磷脂酶地活化，从而导致信号分子N-脂酰鞘氨醇(神经酰胺)地堆积。接下来，N-脂酰鞘氨醇(神经酰胺)能激活JNK导致c-Jun磷酸化和转化因子(ATF-2)地激活[15]。ATF-2和c-Jun能够绑定并开启一种MAPK激酶激酶类促使物，导致Fas-L转录增强。这也可能是氧化诱导下肺上皮凋亡的重要信号机制。Ishii等[16]发现通过抑制JNK活性可改善LIRI。而ERK在LIRI中可能起更重要的作用，Shoji等[17]在15例肺移植前后的肺组织中发现，移植术后磷酸化ERK水平较移植前明显增高，而磷酸化p38及JNK并无明显变化。
2.4 酪氨酸磷酸化途径
酪氨酸磷酸化途径(pathway of tyrosine phosphorylation，PTP)在多种类型的细胞中可影响凋亡。受体蛋白酪氨酸磷酸酶(receptor protein.tyrosine phosphatase，RPTP)是一种单跨膜酪氨酸磷酸酶，与其拮抗的PTK共同调控细胞内的蛋白磷酸化过程。在LIRI等病理过程中，受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)可通过G蛋白偶联的方式调节细胞的存活。多项研究表明，PTK在肺脏、大脑、心脏以及肾脏的缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤修复过程中起重要作用，且主要通过其抗凋亡作用实现。通过研究我们发现，将人肺冷缺血保存2至5小时蛋白酪氨酸磷酸化活动增强，提示在肺移植后再灌注前，人肺组织内倾向于表现出抗凋亡性[18]。但是，我们在实验性人体肺移植过程中发现酪氨酸激酶的酪氨酸磷酸化反应在再灌注初2小时内大幅度降低直到降至基础水平[14，18]。有趣的是，我们在对一例实验性移植研究中发现在缺血肺再灌注初2小时蛋白酪氨酸磷酸酶的促凋亡效应也减低[14]。因此，有促凋亡作用的酪氨酸磷酸酶的水平和具有抗凋亡作用的酪氨酸激酶水平之间的平衡性可能比其各自的水平更有意义。
2.5 血管紧缩素二的作用
通常认为肾素-血管紧张素系统(RAS)是调控血压的内分泌系统。但是，现在的证据说明它可以通过旁分泌和自分泌的形式密切参与凋亡地调控。局部内源性RAS在末梢的肺实质释放，它通过产生血管紧缩素二与上皮AII受体相互作用，这是Fas介导的凋亡所必须的，其在肺泡细胞凋亡信号传导中扮演中心角色[15，19]。我们在对在不同形式的急性肺损伤研究中发现在病人的支气管肺泡灌洗液中血管紧张素转化酶及血管紧张素II是增加的，血管紧张素转化酶可以促使血管紧张素I转化为血管紧张素II[15，19]。我们在对一例啮齿动物肺缺血再灌注模型的研究中发现与对照组相比，抑制血管紧张素可以提高再灌注后的血氧分压，和气道压峰值，并减少肺水肿。抑制ACE所产生的肺保护作用不是通过中性粒细胞隔离及脂质超氧化产生的，而可能是通过Fas/Fas-L凋亡等其他途径。
2.6 AKT信号转导途径
Akt是相对分子质量约为57 000的丝/苏氨酸蛋白激酶。哺乳动物中的Akt是病毒原癌基因v-Akt的同源物。Akt家族的成员有Aktl、Akt2、Akt3 三个亚型，又分别称为PKBα、PKBβ、PKBγ，均参与下游底物的活化，其中以Akt2的作用为主。Akt可以通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad、Caspase-9、NF-κB、Forkhead、mTOR、Par-4、P21等，而介导胰岛素、多种生长因子等诱发的细胞生长，经多种途径促进细胞存活，是重要的抗凋亡调节因子。Akt信号转导途径在心脏、大血管、肺脏等功能活性中具有重要作用。AKT改善I/R损伤的作用对临床治疗有一定意义。
3 凋亡预处理与缺血再灌注肺损伤
缺血预处理是在一次主要的缺血刺激前的一次较短时间的缺血和再灌注，它极大程度地限制了如心、肝和肾等器官的缺血再灌注损伤程度。但是，预处理在肺的相似保护效果我们知之甚少。建立肺缺血预处理模型比建立其他器官的类似模型要复杂得多，因为它拥有双重血供和通气活动，所以研究的难度很高。例如，据报道在通气时阻断肺血供不会导致ATP水平降低。但是萎陷肺停止通气活动与缺氧症的通气活动不同，因为萎陷和复张的机械效果远远比缺血挑战本身重要。在肺缺血预处理的实验性模型发现，缺血再灌注损伤的标志物(丙醛和谷胱甘肽等)和肺动脉压均较非预处理组低。另外，肺内的预处理诱导热休克蛋白复合体也帮助维持离子转运和肺泡内液体清除，从而保护肺缺血刺激后的气体交换功能，降低肺血管通透性。有趣的是，实验性研究显示缺血预处理的时间和形式对获得足够抗缺血再灌注损伤的保护效果也很重要。在以肺缺血再灌注损伤后的肺顺应性作为衡量手段的情况下，多次缺血预处理比单次更能保护肺功能。另外，现在全体缺血或热力预处理的概念已经非常流行。
不同的化学物质也曾被用于肺缺血再灌注前的肺预处理，包括吸入NO和3-nitropropionate。人们认为NO可以起到预处理作用是基于它能诱导肺中性粒细胞凋亡，抑制中性粒细胞释放超氧化物和肺泡巨噬细胞释放炎症细胞因子的机制。线粒体复合物II的抑制剂3-nitropropionate通过抑制再灌注后对细胞的氧化磷酸化和氧化应激也能起到肺预处理作用，并削弱以后的缺血再灌注损伤。
4 临床意义
凋亡和其上游通路很明显促成了缺血再灌注损伤的发展和一些与之相关的临床活动。实验性和临床性研究已经证明两个主要途径导致了肺上皮的细胞程序性死亡，分别是外源性Fas-L-caspase和内源性线粒体途径。大量调控介质和补充途径在对肺缺血再灌注后的凋亡反应的精细调控中起重要作用。理解这些在缺血再灌注后对肺凋亡有调控作用的途径有助于打开降低强烈急性肺损伤的新纪元。例如，现在已经着手研究制药(一氧化氮)和生物分子介入(Fas-L)和腺病毒及质粒地基因调控。这些潜在的治疗手段能帮助防止凋亡途径地进展和减少接受心和肺移植患者的围手术期发病率和死亡率。
5 结 论
直到90年代早期凋亡和其在肺缺血再灌注中的介导者的重要作用才开始被人们所知。现有的证据显示肺缺血再灌注后的凋亡调控机制比以前人们设想的要复杂得多。令人惊讶的是，证据显示由于肺缺血再灌注所引起的肺凋亡和肺功能受损程度之间是不完全一致的。可能这种缺血再灌注后肺内主动地高选择性的细胞凋亡不是像以前所想的一样破坏性强。相对的细胞坏死，与其所伴随的炎症对肺损伤作用可能更强。与再灌注相比单独缺血对肺凋亡仅显示有轻微影响。肺缺血再灌注中的内源性和外源性凋亡途径的全过程及其相关调控因子尚待进一步探索。其他胱门蛋白酶在肺缺血再灌注中的作用需要继续在分子水平的探索。以后对开启和延续肺凋亡的上游途径的研究将基于找到能将肺移植和肺缺血再灌注后肺功能损伤降至最低的治疗方法。
参考文献
[1] Fischer S，Cassivi SD，Xavier A，et al.Cell death in human lung transplantation;Apoptosis induction in human lungs during ischemia and aftertransplantation[J].Ann Surg，2000，231：424-431.
[2] Stemmberger U，Gaspert A，Hillinger S，et al.Apoptosis induced by ischemia and reperfusion in experimental lung transplantation[J].Ann Thorac Surg，2000，69：1532-1536.
[3] Omasa M，Fukuse T，Toyokuni S，et al.Glycine ameliorates lung reperfusion injury after cold preservation in an ex vivo rat lung model[J].Transplantation，2003，75(5)：591-598.
[4] Zhan H，Yenari MA.Cheng D，et al.Bcl-2 overexpression protects again8t neuron loss within the ischemic margin following experimental stroke and inhibits cytochrome C translocation and caspase-3 activity[J].Neuro chem，2003，85(4)：1026-1036.
[5] Neff TA，Guo RF，Neff SB.et al.Relationship of acute lung in flammatory injury to Fas/FasL system[J].Am J Pathl，2005，166(3)：685-694.
[6] Buccellato LJ， Tso M， Akinci OI， Chandel NS， Budinger GR. Reactive oxygen species are required for hypoxia-induced Bax activation and cell death in alveolar epithelial cells[J].J Biol Chem 2004，279: 6753-6760.
[7] Marzo I， Brenner C， Zamzami N， et al. Bax and adenine nucleotide translocator cooperate in the mitochondrial control of apoptosis[J].Science 1998，281:2027-2031.
[8] Cao X， Deng X， May WS. Cleavage of Bax to p18 Bax accelerates stress-induced apoptosis， and a cathepsin-like protease may rapidly degrade p18 Bax[J].Blood 2003，102: 2605-2614.
[9] Cooke DT，Hoyt EG，Robbins RC，et al.Overexpression of human Bcl-2 in syngeneic rat donor lungs preserves posttransplant function and reduces intragraft caspase activity and interleukin-1β production[J].Transplantation，2007，79(7)：762-767.
[10]Ravagnan L，Roumier T，Kroemer G，et al.Mitochondria，the killer organelles and their weapons[J].J Cell Physiol，2002，192(2)：13I-137.
[11]Carmen Peralta，Jose Carlos Perales，Ramon Bartrons，et al.The Combination of Ischemic Preconditioning and Liver Bcl-2 Overexpression Is a Suitable Strategy to Prevent Liver and Lung Damage after Hepatic Ischemia-Reperfusion[J].Am J Pathol，2002，160(6)：2111-2122.
[12]Ekedahl J， Joseph B， Grigoriev MY，et al. Expression of inhibitor of apoptosis proteins in small- and non-small-cell lung carcinoma cells[J].Exp Cell Res 2002，279: 277-290.
[13]Hashimoto N， Takeyoshi I， Yoshinari D，et al. Effects of a p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor as an additive to Euro-Collins solution on reperfusion injury in canine lung transplantation[J].Transplantation 2002，74:320-326.
[14]Sakiyama S， dePerrot M， Han B， Waddell TK， Keshavjee S， Liu M. Ischemia-reperfusion decreases protein phosphorylation and p38 mitogen-activated protein kinase phosphorylation in rat lung transplants[J].J Heart Lung Transplantation 2003，22: 338-346.
[15]Fine A， Janssen-Heininger Y， Soultanakis RP， Swisher SG， Uhal BD. Apoptosis in lung pathophysiology[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2000，279: L423-L427.
[16]Ishii M，Suzuki Y，Takeshita K.et al.Inhibition of c-Jun Nh3 terminal kinase activity improves ischemia/reperfusion injury in rat lungs[J].J Immunol，2004，172(4)：2569-2577.
[17]Shoji T，Yoshida S，Mitsunari M，et al.Involvement of p38 MAP kinase in lipopolysaccharide-induced production of pro-and antiinflammatory cytokines and prostaglandin E(2)in human choriodecidua[J].J Repred Immunol，2007，75(2)：82-90.
[18]Keshavjee S， Zhang XM， Fischer S， Liu M. Ischemia reperfusion-induced dynamic changes of protein tyrosinephosphorylation during human lung transplantation[J].Transplantation 2000，70: 525-531.
[19]10 Martin TR， Nakamura M， Matute-Bello G. The role of apoptosis in acute lung injury[J].Crit Care Med 2003; 31:Suppl. 4， S184-S188.