重组人表皮细胞生长因子对人皮肤细胞增殖作用的研究

作者：刘云召，郝杰，赵洪文，杨云霞

【摘要】 目的：观察重组人表皮生长因子(recombinant human epidermal growth factor，rhEGF) 对人表皮细胞增殖的变化。方法：运用包皮环切术后收集培养角质细胞，不同浓度的重组人表皮细胞生长因子处理细胞，MTT法测细胞生长率；流式细胞仪检测细胞周期以及蛋白的表达。结果：5～10 ng·ml-1重组人表皮细胞生长因子可促进人表皮细胞细胞生长。流式细胞仪检测10 ng·ml-1重组人表皮细胞生长因子处理后细胞增殖明显， S和G2/M期细胞数明显增加。结论：重组人表皮细胞生长因子可促进细胞生长以及切口愈合。

【关键词】 重组人表皮细胞生长因子；人表皮细胞；增殖

细胞增殖、分化、成熟的调控依赖多种活性蛋白质及多肽，统称为生长因子。目前已发现包括表皮生长因子(Epidermal Growth Factor， EGF)在内的多种生长因子。重组人表皮生长因子(recombinant human EGF，rhEGF)是通过人工合成的表皮生长因子基因片段在大肠杆菌表达系统进行有效表达而获得的可促进多类细胞生长的多肽类物质， 其活性和结构与天然产物高度一致[1]。具有广泛的促进细胞增殖和组织再生的生物学活性，对体表创伤、烧伤和溃疡等创面的治疗具有较大的临床应用价值。在制备过程中不同的提取以及纯化方法对多肽的活性影响较大，本文就应用细菌发酵法获得的rhEGF对人表皮细胞的增殖作用进行研究。

1材料及方法

　　1.1试剂

　　重组人表皮生长因子，细菌发酵法获得。DMEM、PRMI1640培养基为美国Gibeo产品，小牛血清、胎牛血清为成都哈里生物工程有限公司；MTT为美国Sigma产品。

　　1.2实验方法及结果

　　1.2.1表皮细胞取材以及培养包皮环切术后标本，PBS洗涤三次，眼科剪剔除多于皮下组织；25%trypsin冷消化过夜，分离表皮与真皮，并去除真皮，制备细胞悬液；1000 rpm×10 min离心，去上清，培养基重新混悬细胞沉淀，用血细胞计数仪计数，并用台盼兰染色，了解细胞存活率。将上述细胞悬液按一定细胞密度接种于培养皿中，置37 ℃，5%CO2孵箱中；2天～3天换液一次；当细胞长满瓶皿70～80%时，根据需要传代或冻存细胞。

　　1.2.2MTT 法测定细胞的增殖取对数生长期细胞1.5×105接种于96 孔培养板内，每孔100 μl，设6 个复孔。加rhEGF使浓度为 0，5，10，20，50，100 ng·ml-1及调零孔加100 μl培养液，继续培养48 h，结束前4 h，加10 μl MTT，常规终止实验，与酶联免疫检测仪上测各孔吸光值，波长490 nm。按下列公式计算相对增殖率（Relative growth rate， RGR）：RGR = 给药孔吸光度值/对照孔吸光度值×100%。

　　1.2.3流式细胞仪检测细胞周期以及蛋白的表达接种2×105个细胞于75ml培养瓶中，待细胞贴壁后加入不同浓度的rhEGF作用于细胞48小时，收集细胞，流式细胞仪检测细胞的增殖，根据细胞周期时相，计算细胞的增殖指数（PI）：PI=(S+G2/M) / (G0/G1+S+G2/M)×100% 。基因产物表达含量分析：上机检测前用PBS 洗离心除去固定液，冰冷PBS 洗涤细胞3 次，按免疫组化方法分别加入cmyc， cfos和cjun单抗，使用浓度1∶100，然后加入荧光素标记的二抗IgG，37 ℃作用30分钟，PBS洗涤，400目筛网过滤，流式细胞仪上机检测。Bios Consort30软件系统处理数据，计算阳性细胞标记率，结果扫描图和数据表示方式显示并打印。统计分析处理（x2检验）比较阴性对照组细胞和试验组细胞间有无显著性差异。

2 结果

　　2.1 细胞形态学观察

　　光学显微镜下，正常生长的细胞大多呈椭圆形，胞体较大，界限清楚（图1）。

　　图1 表皮细胞正常光镜图

　　2.2重组人表皮细胞生长因子对表皮细胞增殖率的影响

　　通过MTT 法测定细胞的增殖，rhEGF在浓度为5～100 ng·ml-1均可以促进人表皮细胞的生长，在10 ng·ml-1时促进细胞的生长作用最为明显。

　　图2 重组人表皮细胞生长因子对表皮细胞增殖率的影响

　　2.3流式细胞仪检测细胞周期以及蛋白的表达

　　rhEGF处理组的细胞在DNA合成前期减少，而处于DNA合成期的细胞增加，增殖率较对照组明显增高， S和G2/M期细胞数增加，G0/G1细胞数减少。表明重组人表皮细胞生长因子可以促进表皮细胞的分裂增殖。基因产物表达含量分析，rhEGF处理细胞后与细胞生长相关基因的表达出现明显的变化，cmyc的标记率和表达量明显升高， cfos和cjun表达量也明显升高，结果见图3。

　　图3重组人表皮细胞生长因子对细胞增殖指数及细胞生长相关基因的蛋白表达

2讨论

　　表皮生长因子（EGF）是广泛存在于人体多种组织的一种多肽因子，具有刺激上皮细胞增生，加快创伤愈合的作用[1]。随着分子生物学的研究进展，人们对创面愈合的调控机制认识不断深化。愈合能力差除与创面产生原因有关外，还与创面本身修复内环境的改变、内源性生长因子含量低下或受体活性下调等因素有关。生长因子在创伤修复中起着举足轻重的作用，调控着创伤的修复。EGF与其受体结合可激活直接调控或诱导细胞增殖的调节生长基因，参与体表创伤的愈合过程，并且为表皮的高速更新所必须。在创伤修复过程中，由于机体本身对创伤部位的修复机制，内源性EGF在创面明显积累，但由于组织中的EGF含量普遍较低，难以满足细胞增殖和肉芽组织发育的需要，因此，理论上外源性的EGF可加速创面的愈合速度[3]。　　重组人表皮生长因子利用基因重组技术人工合成，其结构与天然产物一致，具有促进细胞增殖和组织再生的生物学活性，对体表创伤、烧伤和溃疡等创面的治疗具有较好的临床应用价值。我们研究表明，应用细菌发酵法获得的rhEGF对人表皮细胞具有增殖作用，而且在10 ng·ml-1时作用最为明显。流式细胞术的进一步研究表明rhEGF处理细胞48h后处于DNA合成期的细胞增加，细胞增殖率分别较阴性对照组增加。研究发现cmyc基因与细胞增殖有关，并且与不同的基因群协同控制细胞增殖与分化，参与细胞的调控特别是G0～G1期的过渡。cfos基因蛋白cfos可以识别和结合到基因组中特定的调控序列，从而调控细胞的增殖和分化。cjun所编码的蛋白质对细胞增殖分化中必不可少的基因表达进行调控。我们的研究表明，rhEGF处理表皮细胞后cmyc的标记率和表达量明显升高， cfos和cjun表达量也明显升高，提示rhEGF可以通过与细胞周期有关的基因促进细胞的分裂增殖。

参考文献

1 Jahovic N， Guzel E， Arbak S et al. The healingpromoting effect of saliva on skin burn is mediated by epidermal growth factor (EGF): role of the neutrophils[J]. Burns， 2004， 30(6): 531538.

2 Nagelschmidt M， Becker D， Bonninghoff N et al.Effect of fibronection therapy and fibronection deficiency on wound healing: A study in rats [J].J Trauma， 1987， 27(1): 1267-1271.

3 Cribbs RK， Harding PA， Luquette MH et al. Endogenous production of heparinbinding EGFlike growth factor during murine partialthickness burn wound healing[J]. J Burn Care Rehabil. 2002，23(2): 116-125.

4 郝杰， 彭波， 杨云霞， 等. 重组人表皮生长因子加速皮肤创伤修复的实验研究[J]. 四川生理科学杂志， 2006， 28(4): 156-158.

5 缪世坤， 彭波， 杨云霞， 等. 重组人表皮生长因子对大鼠皮肤烧伤愈合的促进作用[J]. 四川生理科学杂志， 2007， 29(3): 107-108.