【摘要】 目的 研究熊果苷(Arbutin，Arb)与甘草酸(Glycyrrhizin，GL)合用对免疫性炎症的治疗作用。方法 观察Arb与GL合用对佐剂性关节炎及噁唑酮引起的小鼠耳肿胀的影响；测定Arb与GL合用大鼠炎性组织前列腺素E2(PGE2)含量及腹腔巨噬细胞释放白三烯B4(LTB4)的相对含量。结果 Arb与GL合用对福氏全佐剂诱发的大鼠原发性及继发性足肿胀具有抑制作用；Arb和GL合用组对噁唑酮引起的小鼠两耳肿胀有抑制作用，且合用组小鼠血中CD4+T细胞明显降低；GL(400 mg/kg)组及合用组PGE2相对含量显著低于模型组，合用组PGE2相对含量与GL(400 mg/kg)组比较差异无统计学意义；两药合用可抑制大鼠腹腔巨噬细胞释放LTB4。结论 Arb与GL对免疫性炎症具有协同治疗作用。
【关键词】 熊果苷；甘草酸；免疫性炎症；佐剂性关节炎；前列腺素E2；白三烯B4
Abstract：Objective To study the therapeutic effect of arbutin combined with glycyrrhizin on immune-inflammation. Methods The effect of arbutin combined with glycyrrhizin on adjuvant arthritis and on oxzolone induced mice ear swelling were investigated. PGE2 level in inflammatory tissue and LTB4 content from peritoneal macrophage of rat treated with arbutin and glycyrrhizin were determined. Results Arbutin combined with glycyrrhizin could inhibit Freund’s complete adjuvant induced rat primary and secondary foot swelling. The combined group could also inhibit oxazolone induced mice ear swelling and decrease CD4+ T cell in blood. Compared with control group， PGE2 level in combined group was remarkable lower， and there was no difference between combined group and GL 400 mg/kg group. Arbutin combined with glycyrrhizin could inhibit LTB4 release from rat peritoneal macrophage. Conclusion Arbutin and glycyrrhizin has synergetic therapeutic effect on immune-inflammation.
Key words：arbutin；glycyrrhizin；immune-inflammation；adjuvant arthritis；PGE2；LTB4
熊果苷(Arbutin，Arb)是植物熊果、鸡矢藤等的主要化学成分。含熊果苷的传统中药常用于治疗气管炎、感染性泌尿系统疾病、皮肤病、过敏及炎症性疾病。研究表明，熊果苷是酪氨酸酶的竞争性抑制剂，是目前常用的退色药物。甘草酸(Glycyrrhizin，GL)是甘草的主要成分，具有明显的抗炎、抗过敏、解毒等生物学效应。国外有研究报道，熊果苷与肾上腺皮质激素合并可增强后者的抗炎活性，并可以减轻肾上腺皮质激素对动物胸腺、脾脏的抑制作用[1]。我们根据熊果苷与肾上腺皮质激素的协同效应，将熊果苷与甘草酸联合进行抗炎、抗过敏的比较研究，探讨两者联用是否具有协同效应。
1 实验材料
1.1 药物与试剂
甘草酸单铵盐(ammonium glycyrrhizinate，GL)，江苏正大天晴制药有限公司馈赠；Arb、角叉菜胶(Carrageenan Kappa)、福氏全佐剂(FCA)、噁唑酮(Oxazolone，OXA)、巯基乙醇酸钠(Sodium thioglycolate)、花生四烯酸(AA)、钙离子载体A23187、前列腺素E2(PGE2)、白三烯B4(LTB4)、氟灭酸(Flufenamic acid)等均购自美国Sigma公司。Monoclonal antibody mouse CD8、Monoclonal antibody mouse CD4-FITC购自Beckman Coulter公司。其他所用试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器
Agilent1100高效液相色谱仪，岛津UV-2250分光光度计， METTLER TOLEDO AB 104-N电子天平，DK-420电热恒温水浴，YLS-7A足趾容积测定仪。
1.3 动物
Wistar雄性大鼠，体重150～180 g，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK(沪)2003-0003；ICR小鼠，体重18～22 g，浙江省实验动物中心提供，许可证号：SCXK(浙) 2003-0001；SD大鼠，体重150～180 g，浙江省实验动物中心提供，许可证号：SCXK(浙)2004-0014。
2 方法与结果
2.1 对大鼠佐剂性关节炎的影响
Wistar雄性大鼠72只，随机分成6组：阴性对照组、Arb低剂量组(10 mg/kg)、Arb高剂量组(50 mg/kg)、GL低剂量组(50 mg/kg)、GL高剂量组(400 mg/kg)、GL(50 mg/kg)＋Arb (50 mg/kg)组，每组12只。第1日，于右后脚底皮内注射0.1 mL完全福氏佐剂，同一天开始分别腹腔注射药物，连续12 d。腹腔注射的第1日，记录大鼠体重和两侧脚掌的体积。第5日，再次测量被注射脚掌的体积，代表这一时期的原发病变和治疗性药物的作用，随后用容积测定仪测量脚掌的体积，代表诱导的佐剂性疾病的严重程度。第13～21日，停止给药。第21日，再次用容积测定仪测量脚掌的体积，代表继发性病变的严重程度。于造模前、造模后第5日和第21日分别测量大鼠右足(注射佐剂足)和左足的足爪容积，各组大鼠分别以给药前后的足爪容积差值为肿胀度。结果见表1。表1 Arb与GL对佐剂性关节炎大鼠足肿胀的影响(略)
2.2 对噁唑酮引起接触性过敏反应的影响
ICR雄性小鼠90只，分组同“2.1”项。每只小鼠腹部涂擦3% OXA(无水乙醇∶丙酮＝3∶1)溶液150 μL，致敏后第7日用1% OXA花生油液20 μL涂小鼠两耳，各组在激发前及激发后16 h 腹腔注射药物，激发前、激发后24 h，在戊巴比妥轻微麻醉下测量两耳厚度。每组取6只小鼠断头取血，用流式细胞仪测定CD4+、CD8+。结果见表2、表3。 表2 Arb与GL对噁唑酮引起小鼠耳肿胀的影响(略)注：与阴性对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01(下同) 表3 Arb与GL对噁唑酮引起的接触性皮炎小鼠T-淋巴细胞增殖(略)
2.3 对大鼠炎性组织中前列腺素E2含量的影响
雄性SD大鼠90只，体重150～180 g，分组同“2.1”项，每组15只，腹腔注射给药，给药后0.5 h，于右后足跖皮下注射1%角叉菜胶0.1 mL，致炎4 h后处死大鼠，在关节上0.5 cm处剪下炎性肿胀足，按文献[2]方法处理，于波长278 nm处测定其光密度值。以每克炎性组织相关的吸收光密度值表示PGE2的含量。结果见表4。表4 Arb与GL对角叉菜胶引起大鼠肿胀足PGE2含量的影响(略)
2.4 对大鼠腹腔巨噬细胞释放白三烯B4的影响
Wistar雄性大鼠35只，分为7组，每组7只，实验前3 d每鼠经腹腔注入3%巯基乙醇酸钠3 mL/kg。实验时断头放血处死，腹腔注入3 mL Tris-HCl溶液，轻揉腹部，吸取腹腔液2 mL，离心，弃上清液，用无Ca2+、Mg2+的Dulbecco液配成浓度为15×107个细胞/mL的细胞悬液。在37 ℃水浴振荡温孵10 min，药物组加入各浓度药物5 μL，阴性对照组加孵化液、Arb(10 μg/mL)、Arb(50 μg/mL)、GL(25 μg/mL)、GL(200 μg/mL)、GL(25 μg/mL)＋Arb (50 μg/mL)，阳性对照组加氟灭酸1×10-4 mol/L。在各管细胞悬液中加入下列物质5 μL使其终浓度分别为：AA 50 μmol/L，A23187 1 μmol/L、Ca2+ 2.0 mmol/L、Mg2+ 0.5 mmol/L，再温孵水浴振荡4 min后，加入无水乙醇3 mL终止反应。按文献[3]方法，以LTB4与内标PGE2峰高之比表示其相对含量。结果见表5。表5 Arb与GL对大鼠腹腔巨噬细胞释放LTB4的影响(略)
2.5 统计学方法
数据以x±s表示，显著性检验用非配对t检验。P≤0.05或P≤0.01认为具有统计学意义。
3 讨论
Arb广泛存在于多科属植物中，具有抗菌、镇咳、利尿等功效。早年研究表明，Arb能增强类固醇皮质激素，对T淋巴细胞介导的迟发型超敏反应(DTH)有抑制作用，但单独应用Arb对DTH的抑制作用不明显[1]。Arb在抗炎免疫方面的研究尚未见报道。
GL为甘草的主要成分，具有抗炎、抗过敏、抗病毒等多种药理作用[4]，其中对T细胞介导的细胞免疫反应、佐剂性免疫性炎症(关节炎)包括巴豆油、醋酸所致的急性炎症、棉球诱发的慢性炎症均有抑制作用，GL的抗炎作用与其结构式与皮质类固醇类激素类似有关。GL临床已广泛用于治疗慢性肝炎，但是大剂量长期应用可出现低血钾、高血压、水肿等伪醛固酮症不良反应。为了克服GL的不良反应，本研究将GL与Arb联用，并观察两者抗炎症的协同效应。结果显示，50 mg/kg剂量的Arb加等剂量的GL对福氏全佐剂引起大鼠足垫肿胀有抑制作用，但单独使用Arb或GL对大鼠足垫肿胀仅呈抑制趋势，与阴性对照组比较，其差异无统计学意义。对OXA诱导的小鼠接触性皮炎(耳廓肿胀)，GL与Arb联用或单独使用均呈显著的抑制作用。实验结果表明，GL与Arb联用对FCA及OXA两种不同抗原诱导的DTH均呈明显抑制作用，而分别单独使用对FCA诱导的免疫性炎症仅呈抑制趋势，提示两者联用主要作用于DTH诱导的细胞免疫过程，即抑制了T-淋巴细胞的活化与增殖。此外，用流式细胞仪测定OXA致敏小鼠血液CD4+细胞和CD8+细胞，结果GL及Arb单独使用对CD4+细胞和CD8+细胞均有抑制作用，而两者联用的抑制作用更强，对CD4+/CD8+比值的抑制作用亦呈增强趋势，说明对CD4+细胞的抑制作用更强。提示GL及Arb可能通过降低免疫炎症性疾病体内活化的T细胞数量，调整T细胞亚群比例，从而恢复正常的免疫状态有关。对角叉菜胶致大鼠急性炎症组织PGE2的含量和大鼠腹腔巨噬细胞释放LTB4的影响实验结果表明，不同剂量药物治疗组中大鼠炎症组织中PGE2含量及大鼠腹腔巨噬细胞释放LTB4的相对含量与对照组比较，均呈下降趋势，其中GL与Arb联合应用的抑制作用较强。PGE2既是炎症介质，又是免疫调节物质，参与一系列重要的生理与病理过程；LTB4是花生四烯酸的5-脂氧酶代谢物，具有多种活性，是一个极强的白细胞趋化剂和聚集剂，也是重要炎症介质，参与了免疫性炎症，如类风湿性关节炎、哮喘、痛风等病理过程。研究提示，GL与Arb联用对PGE2和LTB4的影响可能是其抗炎与免疫调节作用的机制之一，并发挥两者抗炎免疫的协同作用。
参考文献
[1] Hideaki M， Haraka N， Takayuki T. Pharmacological study on Arcto- staphylos UVa-Ursi(L.) SprengⅡ. Combined effects of arbutin and prednisolone or dexamethazone on immuno-inflammation[J]. J Pharm Soc，1990，110(1)：68－76.
[2] 陈 奇.中药药理学研究方法学[M].北京：人民卫生出版社，1993. 370－371.
[3] Li NY， Zhu XY. Effect of some anti-inflammatory drugs on biosynthesis of leukotriene B4[J]. Acta Pharm Sinic，1988，23(2)：104－107.
[4] Zhu RZ. Antiinflammatory and immune regulating effct of sodium glycyrrhetinic acid by oral administration in mice and rats[J]. Chin Pharm Bull，1996，12(6)：542－544.