化疗药物对膀胱癌细胞CCR9的表达影响及临床意义分析

【摘要】 目的：研究化疗药物对膀胱癌细胞的CCR9表达的影响，初步探讨CCR9在膀胱癌细胞的转移与侵袭中的作用。 方法：研究采用PCR法、流式细胞术以及趋化小室的体外侵袭实验等方法进行研究。结果：研究发现CCR9在膀胱癌细胞5637上高表达而在化疗药物处理组中低表达，同时发现CCL25与CCR9的相互作用影响膀胱癌细胞的转移和侵袭能力，初步证实了CCR9在膀胱癌细胞的转移和侵袭中的作用。

【关键词】 膀胱癌; CCR9; 转移; 侵袭

大多数肿瘤相关的死亡与转移有关，因此，将肿瘤的转移最小化已经成为大势所趋。目前为止，关于肿瘤的转移的细胞和分子机制还不清楚[1]，瘤细胞的扩散可能与其迁移、侵袭及归巢能力等众多因素相关，大多数肿瘤细胞的转移有着与白细胞的迁移有很多相似之处，如都通过趋化因子受体与配体的相互作用进行调节等机制，有研究已经证实CCR9的表达与多种肿瘤细胞的迁移和侵袭有关，如克罗恩病[2，3]、转移性黑素瘤[4，5]、慢性淋巴细胞性白血病[6]等，其作用主要是通过CCR9与其配体CCL25的相互作用实现[4，7～9]的，研究证实CCR9的高表达可以促进前列腺癌细胞的转移和侵袭能力[10]，在我们的研究中，我们对比药物处理前后的膀胱癌细胞初步证实CCR9同样与膀胱癌细胞的转移和侵袭能力相关，膀胱癌细胞高表达CCR9，化疗药物顺铂、干扰素a等处理组的细胞

　　1 材料与方法

　　1.1 主要的实验材料

　　膀胱癌细胞系5637细胞(由本研究室保存);RNA提取的主要 试剂Trizol、异丙醇;PE标记的抗人的CCR9抗体(购自eBiosience公司)以及同型对 照抗体PE标记的抗人的IgG2a;趋化小室购自Sigma公司;CCL25购自Sigma;卡介 苗BCG、干扰素a以及顺铂购自当地医院。

　　2 主要的实验方法

　　2.1 细胞培养

　　膀胱癌细胞系5637细胞购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。37℃，5%CO2条件下含2mmol/L的谷氨酰胺及10%的胎牛血清的1640培养基培养5637细胞培养备用。药物处理组细胞加入大于常规剂量的药物处理24 h。

　　2.2 RNA提取和CCR9表达的分析

　　人CCR9的mRNA的序列从GenBank中获取(XM003251)，使用Primer5.0软件设计引物进行RTPCR分析，扩增产生162bp大小的 CCR9。常规方法提取膀胱癌5637细胞以及药物处理后的细胞的RNA，分别收集未处理组及化疗药物处理组细胞2*106/组，加入1ml TRIZOL溶液，用手反复摇匀至细胞碎块完全被裂解，然后将上述样品静置15～20min后，每管加入0.2ml氯仿(0.2ml/ml)，在手中反复振荡摇匀，室温静置10min;将EP管置于高速台式冷冻离心机;在4℃ 12000r/min离心10min;小心吸取上层水相置于另一无菌的新的EP管中;于管中加入05ml异丙醇，室温沉淀10min;4℃ 12000r/min离心10min，弃上清，沉淀用75%无水乙醇洗两次;最后让沉淀的RNA在室温自然干燥;每管用8～10μl无RNAase的纯水重悬干燥后的RNA，置于冰浴立即用于cDNA合成或置-70℃长期保存。

　　2.3 流式细胞术测定化疗药物处理前后膀胱癌细胞表面CCR9的表达

　　收集化疗药物处理前后的5637细胞，2*106/组，每组细胞加入1微克的PE标记的抗人的CCR9抗体或PE标记的抗人的IgG2a同型对照抗体，4℃孵育30min;含1%BSA的PBS洗3次后流式细胞仪检测。

　　2.4 膀胱癌细胞迁徙与侵袭实验

　　CCL25购自PeproTech公司，未标记的鼠抗人的CCR9抗体购自R&&D公司。先将100微升5 mg/ml 的Matrigel加到24transwell的上室中，37℃孵育5 h，然后用无血清培养基轻洗凝胶，备用。在上室中加入200微升细胞悬液(2×106个/毫升)，下室中加入200微升含0.5%BSA的RPMI1640，其中CCL25终浓度为0ng/ml及100ng/ml 。 此外，为了阻断趋化因子受体之间的相互作用，同时设定在上室中加入1.0微克/毫升的鼠抗人的CCR9抗体与100ng/mlCCL25的对照组。置于温箱中孵育1h。然后将膜轻轻取下，放于1%的考马斯亮蓝中染色5分钟，PBS清洗后在显微镜下计数细胞数。

　　3 实验结果

　　3.1 不同化疗药物处理前后膀胱癌细胞CCR9的RNA表达水平比较

　　收集未经化疗药物处理的膀胱癌细胞及经药物处理24小时的细胞，提取其mRNA并经RTPCR法检测发现，与未经化疗药物处理组相比，经药物处理后，膀胱癌细胞的CCR9的mRNA的表达水平显著下降(*P&<0.05)，顺铂处理组下降最显著(**P&<0.01)。见图1。

　　3.2 流式细胞术检测药物处理前后膀胱癌细胞表面CCR9表达的变化

　　收集细胞，以PE标记的抗人的CCR9抗体进行标记，以PE标记的抗人的IgG2a抗体作为同型对照抗体，流式细胞仪检测CCR9的表达，发现经化疗药物处理各组的CCR9表达水平明显下降(*P&<0.05)，见图2。

　　图1 经药物处理后膀胱癌细胞的CCR9的mRNA的

　　表达水平显著下降

　　图2 经化疗药物处理各组的CCR9表达水平明显下降

　　3.3 细胞迁徙与侵袭实验

　　肿瘤细胞迁徙及侵袭实验结果显示，无论是化疗药物未处理组的膀胱癌细胞还是药物处理后的细胞，在没有CCL25参与的情况下，细胞几乎没有迁移作用;但当加入100ng/ml的CCL25后，细胞即发生迁移，且未经化疗药物处理的膀胱癌细胞迁移率明显高于药物处理组细胞，加入CCR9抗体后，其迁移率便降低(图3A，*P&<0.01);与迁徙实验一样，实验发现膀胱癌细胞的侵袭能力也与CCR9、CCL25相关，化疗药物处理后，其侵袭能力降低(图3B ， *P&<0.05)。

　　图3A 膀胱癌细胞的侵袭能力与CCR9、CCL25相关

　　图3B 化疗药物处理后膀胱癌细胞的侵袭能力降低

　　4 讨论

　　大多数膀胱癌相关的死亡并不是由原发的肿瘤引起的，而是由膀胱癌细胞的扩散到其它的组织器官引起的。目前关于膀胱癌的转移机制还研究的甚少，也有研究证实一些生物分子参与肿瘤的转移。化学因子参与淋巴细胞的趋化作用并导致肿瘤细胞向特定的位点归巢促进器官特异性的转移[11]。

　　我们的研究假设趋化因子受体CCR9参与并介导膀胱癌细胞的转移和侵袭，为了证明我们的假设，我们首先比较了膀胱癌细胞在化疗药物处理前后CCR9的表达变化，同时我们也首次利用体外的迁移侵袭实验研究了CCR9的表达在膀胱癌细胞转移侵袭中的生物学及功能学意义。我们研究发现，CCR9在膀胱癌细胞表面高表达，而在顺铂等化疗药物处理后发现CCR9的表达降低，且具有统计学意义。另外，迁移侵袭实验证明，药物未处理组的膀胱癌细胞具有很强的向CCL25迁移和侵袭能力。如果使用单克隆抗体封闭CCR9后，会明显降低膀胱癌细胞的转移和侵袭，这初步表明膀胱癌细胞的转移和侵袭依赖于趋化因子及其受体的相互作用。

　　与CXCR4不同，尽管已经有研究证实CCR9表达与胸腺、淋巴结和脾脏，但关于癌组织及正常的上皮组织表达CCR9的研究几乎没有[12，13]。CCR9的受体CCL25可以激活树突状细胞和胸腺细胞[14]。我们的研究首次证实CCR9表达于膀胱癌细胞系5637细胞上，CCR9抗体阻断实验证明CCR9的表达在膀胱癌细胞的转移和侵袭中发挥着重要的作用，CCL25选择性的表达于淋巴结同时CCR9与CCL25的相互作用在膀胱癌的转移浸润中发挥着重要作用。

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