关于布地奈德吸入对支气管哮喘大鼠支气管Eos和STAT6表达的调控作用

（） 【摘要】 目的 研究布地奈德(BUD)对支气管哮喘大鼠支气管Eos和STAT6表达的调控作用。方法 30只清洁级幼年健康雄性Wistar大鼠经造模后，随机分为对照组、哮喘组和BUD组。实验结束后对支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织匀浆进行细胞总数、嗜酸性粒细胞(EOS)计数和分类计数；应用双抗体夹心酶联免疫吸附试验法测定血清中IL-4的含量；采用免疫组化法检测STAT6蛋白表达的变化。结果 (1) 哮喘组BALF中细胞总数、EOS绝对值和EOS占细胞总数的百分比(EOS％)均显著高于对照组(P&<0．01)，BUD组BALF中上述各项指标较哮喘组均显著降低P&<0.01)；(2)BALF中IL-4的浓度哮喘组显著高于对照组(P&<0．01)，BUD组较哮喘组显著降低(P&<0.01)，而IL-4的浓度哮喘组显著低于对照组(P&<0.01)，BUD组较哮喘组显著升高(P&<0.01)；(3) 哮喘组支气管上皮细胞STAT6蛋白阳性表达较对照组明显增强(均为P&<0.01)，BUD组较哮喘组明显减弱(均为P&<0.01)。结论 哮喘大鼠支气管STAT6较强表达，上皮细胞是其主要表达细胞；BUD有抑制气道炎症的作用，下调STAT6及其基因表达，使IL-4合成减少可能为其重要作用机制。
【关键词】 布地奈德 哮喘 信号转导子和转录激活子6(STAT6) IL-4
　　支气管哮喘是世界范围内严重威胁公众健康的主要慢性疾病之一，其发病率和死亡率呈上升趋势，已引起世界各国学者的高度重视和广泛关注，哮喘已成为患者家庭及社会一个沉重负担。哮喘时由于变应原，细胞因子等的诱导，导致STAT6的持续活化，过度表达，促进Th3的募集，增殖和优势表达IL-4，IL-3等Th3型细胞，使Th1/Th3比例失衡，通过STAT6诱和趋化EOS等细胞向气道的炎症部位聚集，引起气道炎症反应和AHR，因此STAT6有望成为治疗哮喘的有效靶分子，研究针对STAT6的拮抗剂或抑制剂，通过调控STAT6所介导的信号转导系统来调控免疫系统，将为临床治疗哮喘开辟新的途径。
　　1 材料与方法
　　1.1材料
　　实验动物
　　一级（普通级）健康雄性Wistar大鼠，5～6周龄，30只，体重200～220g，由佳木斯大学医学院实验动物中心提供。
　　1.2方法
　　1.2.1实验设计和分组
　　将30只Wistar大鼠根据随机数字表法随机分为3组：OVA致敏及激发哮喘模型组、BUD干预组、正常对照组，每组10只。
　　1.2.2实验试剂及材料
　　卵白蛋白（OVA）美国sigma公司（进口分装）；液态铝（Alum)美国PIERCE公司（批号20090222）；布地奈德雾化液(BUD)澳大利亚阿斯利康公司（批号20090516）；大鼠用STAT6免疫组化检测试剂盒，购自武汉博士德生物工程有限公司。
　　1.2.3动物模型制作
　　（1）致敏及激发哮喘阶段：参考苗会、薛全福等[1]人的研究报道制作哮喘模型，模型组大鼠在实验第1天于腹腔注射致敏原（含0.01％OVA0.1ml及液态铝0.1ml，充分混匀30min），之后于实验第8天及第15天腹腔注射加强致敏，注射量相等，共2次。实验第22天起将大鼠置于自制45cm×30cm×25cm有机玻璃箱中雾化吸入1％OVA溶液4ml激发哮喘，每天一次，每次30min，持续7天。正常对照组用等量NS替代OVA。
　　（2）BUD干预阶段：布地奈德组大鼠同模型组致敏及激发，激发前30min给予0.2mgBUD雾化吸入，每天一次，每次30min，持续7天。模型组、正常对照组用等量NS代替，持续时间相等。
　　1.2.4动物处理
　　各组大鼠于最后一次雾化激发12小时以1000u/ml肝素0.2ml腹腔注射抗凝，1％戊巴比妥钠(30mg/Kg)腹腔注射麻醉，眼球放血、颈椎脱臼法处死大鼠，采集标本。
　　1.2.5试验指标采集与测定
　　（1）取血清：大鼠麻醉后用1000u/ml肝素0.2ml腹腔注射抗凝，用弯镊摘取双侧眼球取血约1ml，血液用低速离心机以2000r/min速度离心20min，取血清，-20℃保留，用ELISA法测定血清中IL-4水平。
　　（2）收集支气管肺泡灌洗液（BALF）：取血完毕后，即刻行气管插管左肺支气管肺泡灌洗生理盐水5ml×6，回收肺泡灌洗液(BALF)，回收率&>90%。取BALF回收液3ml经双层无菌纱布过滤，在4℃、1200 r/min离心10min分离细胞。离心沉淀细胞用生理盐水冲洗并调整细胞数为1.0×109/L，在细胞计数板上计数细胞总数。取已调整细胞数的BALF 30μL，用特制的细胞涂片离心支架在4℃、1200 r/min离心10 min，通过离心作用使一定量细胞均匀平铺于载玻片上，冷风吹干，经HE染色后在高倍镜下计数100个细胞，同时进行细胞分类计数，每例动物计数3张涂片。
　　（3）肺组织收集及处理
　　支气管肺泡灌洗后迅速打开胸腔，取出左肺，蒸馏水冲洗，无菌处理，于4％多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋、切片，进行HE染色和STAT6免疫组化检测。
　　1.3 STAT6表达的测量方法
　　采用图像分析仪对图像进行分析。每张切片在光学显微镜下放大400倍，随机选择至少5个高倍视野后，测定着色细胞平均吸光度(OD)，计算其平均值作为该切片的代表值。
　　1.4 统计学处理
　　数据均以均值±标准差（x-±s)表示，统计学处理采用SPSS 11.5软件进行单因素方差分析，多个样本均数的两两比较采用LSD检验，单个样本前后比较采用配对T检验，取P＜0.05为有统计学意义，P＜0.01为有显著差异。
　　2 结果
　　2.1症状观察
　　模型组所有大鼠致敏激发后都出现烦躁不安、易惊、抓耳挠腮、毛发倒伏、大小便增多、呼吸增快、口唇发绀、腹部痉挛、弓背、最后伏俯不动等急性过敏反应，而治疗组及正常组相对较安静。所有大鼠无死亡。
　　2.2各组大鼠肺泡灌洗液中细胞成分比较
　　哮喘组及BUD组大鼠BALF中细胞总数，嗜酸性粒细胞（EOS）和中性粒细胞（N）占总白细胞的百分比均高于正常对照组（P&<0.05）；而BUG组BALF中白细胞总数、EOS%和N%均低于哮喘组组（P&<0.05），但仍高于正常对照组（P&<0.05）。见表1。
　　表1 各组大鼠肺泡灌洗液中细胞成分组成（x-±s）
　　
　　注：与正常组比较，*P&<0.05；与模型组比较，△P&<0.05
　　2.3各组大鼠BALF中WBC总数及Eos比例比较
　　大鼠BALF中，模型组WBC总数及Eos百分比较正常组明显增高，差异有显著性意义（P＜0.01）；治疗组WBC总数及Eos百分比较A组明显降低，差异有显著性意义（P＜0.01）；治疗组WBC总数虽稍高于正常组，但无明显差异（P＞0.05），治疗组Eos百分比仍较正常组高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。
　　表2 各组大鼠BALF中WBC总数及Eos比例比较(x-±s)
　　
　　注：与正常组相比较★P＜0.05 ●P＜0.01，与模型组相比较▲P＜0.01 转贴于 　　 2.4各组大鼠血清中IL-4的含量比较(x-±S)
　　大鼠血清中IL-4的含量，模型组血清中IL-4的含量较正常组明显增高，差异有显著性意义（P＜0.01）；治疗组血清中IL-4的含量较模型组明显降低，差异有显著性意义（P＜0.01），但治疗组血清中IL-4的含量仍较正常组高（P＜0.01），见表3。
　　表3 各组大鼠血清中IL-4的含量比较(x-±S)
　　
　　注：与正常组相比较★0.01，与模型组相比较▲P＜0.01
　　2.5各组大鼠STAT6表达的比较
　　大鼠气管的STAT6表达，模型组STAT6表达较正常组明显增高，差异有显著性意义（P＜0.01）；治疗组STAT6表达较模型组明显降低，差异有显著性意义（P＜0.01），但治疗组STAT6表达较正常组仍高（P＜0.01），见表四。
　　表四 各组大鼠支气管STAT6的表达结果的比较(x-±S)
　　
　　与正常组比较★P＜0.01 与模型组比较▲P＜0.01
　　3 讨论
　　支气管哮喘是多基因遗传和环境因素相互作用的变态反应性疾病，各种因素包括Eos、T淋巴细胞、气道上皮细胞等及其分泌的几十种细胞因子共同参与引起气道慢性炎症，继而气道高反应性和可逆性气流受限。临床上使用糖皮质激素治疗哮喘可以明显减轻哮喘的症状，减少发作次数和改善肺功能，疗效已得到肯定。其作用可能是通过抑制淋巴细胞与巨噬细胞及其分泌的多种细胞因子的合成，抑制Eos的趋化与活化，减少白三烯和前列腺素的合成并抑制其代谢，促使小血管收缩、增高其内皮的紧密度、减少血管渗漏，抑制炎症细胞趋化，活化并提高呼吸道平滑肌β2受体的反应性和增加细胞膜上β2受体的合成，抑制组胺酸脱羧酶、减少组胺的形成，增加PGE受体的数量，抑制支气管腺体中酸性黏多糖的合成，减少血浆素原激活剂的释放及弹性蛋白酶和胶原酶的分泌等[2]，从而抑制炎症反应和延缓气道重塑，使哮喘的临床症状得以控制。
　　目前关于糖皮质激素作用机制的研究达到分子水平，认为这种小分子脂溶性物质容易通过细胞膜进入细胞内，与胞质中的受体结合，活化的激素受体复合物随后转移至细胞核，链接在糖皮质激素敏感基因启动子区的应答元件DNA位点， 调控DNA的转录和蛋白质合成，从而发挥其生物学效应。Soe等[3]研究发现，糖皮质激素可调控靶基因的转录，抑制STAT6的磷酸化及减少STAT6与CD23启动子结合，从而抑制IL-4的分泌， 并通过下调JAK1及STAT6表达抑制IL-4和IL-13的进一步升高，防止气道上皮细胞的增生，杯状细胞化生和黏液合成增加，气道上皮下胶原沉积减少，α-SMA表达下调，从而控制哮喘气道重塑的进展[4]。但也有实验提出， 吸入糖皮质激素并不能用于防止气道重塑[5]。而Heller等[6]也发现，气道上皮细胞STAT6表达、激活、核转移以及与靶基因结合均不受糖皮质激素的影响。本实验中作者发现，地塞米松组与哮喘组小鼠相比，气道及肺组织中STAT6表达明显减少， 该过程伴随着动物BALF中白细胞、Eos的减少，气道炎性浸润减轻，杯状细胞减少等，提示治疗有效，与文献报道是一致的，证实了STAT6信号转导途径在调控变应性疾病的基因表达方面起重要作用。
　　本实验研究显示哮喘模型组BALF中WBC总数、Eos比例均明显高于正常对照组，经BUD干预治疗后BALF中WBC总数、Eos比例明显降低，BALF中WBC总数与正常对照组接近，但BALF中Eos比例仍高于正常对照组，提示雾化吸入BUD可以抑制哮喘大鼠Eos的产生。提示气道炎症一旦形成，可能需要较长时间来控制。有研究也表明哮喘患者尽管吸入激素或口服激素，气道粘膜Eos性炎症仍持续存在，这与临床上哮喘的患者需要长期吸入激素来控制哮喘变态反应性炎症相符。
　　本实验中，从肺组织病理观察结果提示BUD具有抗炎作用，能减轻粘膜水肿，减轻支气管痉挛，从而减轻AHR及气道重塑。
　　综上所述，BUD雾化吸入能显著改善哮喘大鼠的症状及气道炎性病理变化，抑制炎性细胞的表达，其具体的作用机制有待进一步研究。=
　　参 考 文 献
　　[1]苗会，薛全福，庄逢源等.哮喘大鼠动物模型的制备[J].基础医学与临床，1998，18(l):72-78.
　　[2]Doniec Z．Anti inflammatory action of corticosteroids in bronchial asthma mechanism of action and pathophysiologic aspects [J].Pncumonol Alergol Pol，1997，65(Suppl1)：66-70．
　　[3]Soe Y，Kim SH，Park HH，et a1．Corticosteroid inhibits IL-4 singaliug through down-regulation of IL-4 receptor and STAT6 activity[J].FEBS Letters，2002，518:53-59.
　　[4]陈晓红，钟南山，张卫东等．布地奈德对哮喘小鼠气道重塑及JAKI/STAT6表达的影响[J]．中华医学杂志，2007，87:1627-1632.
　　[5]Panetfier RA. Effects of corticosteroids on structural cells in asthma and chronic obstructive pulmonary disease[J]．Proc Am Thorac Soc，2004，1:231-234.
　　[6]Heller HM，Matsukura S， Georas SN. Assessment of signal transducer and activator of transcription 6 as a target of glucocorticoid action in human airway epithelial cells[J]．Clin Exp Allergy，2004，34:1690-1700.转贴于