μ型阿片受体和催产素受体二聚化的分析

【摘要】 目的 探讨μ型阿片受体（MOR）和催产素受体（OTR）可否形成异源性受体二聚体。方法 采用免疫共沉淀(IP)和荧光共振能量转移(FRET)方法，检测在MOR和OTR质粒共转染中国仓鼠卵巢（CHO）细胞和大鼠脑组织中是否存在MOR和OTR异源二聚体。结果 IP方法检测显示，在MOR和OTR质粒共转染CHO细胞及大鼠脑组织中可见MOR和OTR蛋白条带。MOR和OTR共转染CHO细胞FRET方法检测信号为阳性（FRET率均值为2.01）。结论 在MOR和OTR质粒共转染CHO细胞及大鼠脑组织中存在异源性MOR和OTR二聚体。
【关键词】 受体 阿片样 μ 受体 催产素 受体 G蛋白耦联
［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the existance of heterodimers of μ opioid receptor (MOR) and oxytocin receptor (OTR). MethodsThe immunoprecipitation (IP) and fluorescence resonance energy transfer (FRET) were used to study the dimerization of MOR and OTR in the Chinese hamster ovary cells (CHO) cotransfected by MOR and OTR plasmid and in the rat brain tissue.ResultsThe bands of MOR and OTR were seen in the cotransfected CHO cells and rat brain tissue via IP test. The FRET signal was positive in the cotransfected CHO cells (average value of FRET rate was 2.01). ConclusionThe heterodimers of MOR and OTR exist in the cotransfected CHO cells and brain tissues.
　　［KEY WORDS］receptors， opioid， mu; receptors， oxytocin; receptors， Gprotein coupled
　　阿片受体存在着μ、κ和δ三种亚型阿片受体，并在体内广泛分布[1，2]。有关研究显示，吗啡可以抑制大鼠视上核和室旁核催产素的合成释放[3，4]。KUTLU等[5]在孕鼠脑中也发现了吗啡抑制催产素释放的作用。吗啡和催产素无论在结构还是受体后信号转导上都存在很大差异，吗啡是通过什么途径来影响催产素的合成释放？本文采用免疫共沉淀(IP)和荧光共振能量转移(FRET)方法来检测μ型阿片受体（MOR）和催产素受体（OTR）间是否可以形成异源性的受体二聚体，以期为进一步探讨吗啡抑制催产素合成与释放的机制提供分子学基础。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　实验所需质粒均由第二军医大学神经生物学教研室提供。MOR和OTR抗体由第二军医大学神经生物学教研室制备。脂质转染购自Qiagen公司。荧光抗体购自Rockland公司。蛋白A胶联珠购自Pharmacia公司。大鼠购自中国科学院动物中心。
　　1.2 方法
　　1.2.1 细胞培养 中国仓鼠卵巢（CHO）细胞培养以含体积分数0.10胎牛血清的PRMI 1640为培养基，在37 ℃、含体积分数0.05二氧化碳的培养箱中培养。
　　1.2.2 转染 CHO细胞均匀分布在瓶底80%的面积时，用pcDNA3.1MOR、pcDNA3.1OTR质粒单转或双转CHO（MOROTRCHO）细胞，具体步骤按照脂质转染试剂操作说明进行。
　　1.2.3 免疫细胞荧光和IP检测 具体步骤参照分子克隆。
　　1.2.4 脑组织裂解 脑组织裂解方法参考MIKAELA等[6]的方法，大鼠脑组织在NP 40组织裂解液中行匀浆处理，低温超速离心30 min，取上清存于-70 ℃冰箱待用。
　　1.2.5 FRET CHO细胞接种于无菌玻片上，分5组进行质粒转染：共转pECFPN1和pEYFPN1组（阴性对照组），转染pECFPYFP组（阳性对照组），共转pECFPN1MOR和pEYFPN1OTR组（实验组），单转pECFPN1MOR组，单转pEYFPN1OTR组。荧光质粒瞬时转染48 h后将玻片置于三通道FRET荧光显微镜下， 应用成像软件Imageproplus version 5.0.1拍摄图像。参照DAVID的方法对FRET图像进行分析。
　　2 结　　果
　　2.1 MOR和OTR异源二聚体的IP检测
　　野生型CHO细胞或MOROTRCHO细胞以MOR抗体为IP抗体，OTR抗体做免疫印迹（IB）检测，结果显示，野生型CHO细胞泳道中无条带出现，MOROTRCHO细胞泳道上有相对分子质量约为 54 000的蛋白条带（图1a）。将IP抗体和IB抗体互换后重复上述实验，结果显示，野生型CHO细胞泳道中无条带，而MOROTRCHO细胞泳道上有相对分子质量67 000左右的蛋白条带（图1b）。
　　2.2 大鼠脑组织中MOR和OTR的受体二聚体
　　大鼠脑组织裂解液，以MOR抗体和OTR抗体交替作为IP抗体和IB抗体，结果与MOROTRCHO细胞的免疫共沉淀结果一致（图1）。
　　图1 MOROTRCHO细胞和脑组织裂解液免疫共沉淀
　　图1a ①MOROTRCHO细胞，②脑组织，③野生型CHO细胞;IP抗体:MOR抗体 (1∶1 000)，IB抗体:OTR抗体(1∶500)，二抗：1∶10 000。图1b ①MOROTRCHO细胞，②野生型CHO细胞，③脑组织;IP抗体:OTR抗体(1∶1 000)，IB抗体: MOR抗体(1∶1 000)，二抗：1∶10 000
　　2.3 MOR和OTR异源二聚体的FRET检测
　　阴性对照组CHO细胞FR值为1.43±0.12，阳性对照组为2.21±0.18，实验组为2.01±0.17。实验组FR均值明显高于阴性对照组（P&<0.05），而实验组与阳性对照组间差异无显著性（P&>0.05）。
　　3 讨　　论
　　GPCRs受体多聚化正在受到越来越多的重视，目前发现GPCRs三个主要家族均有能形成多聚体的受体。本文证实了同属于GPCRs受体A族的MOR和OTR在体外培养细胞和大鼠脑组织内均可形成异源性二聚体。
　　在IP检测MOR和OTR共转染CHO细胞及脑组织裂解液时，MOR蛋白均显示为一条相对分子质量67 000左右的条带，而根据NCBI基因库中的MOR核酸序列计算，MOR蛋白相对分子质量为45 000。THOMPSON等[7]在1993年报道MOR序列中有5个与氮相连的糖基化位点、2个棕榈酰化位点和3个磷酸化位点，因此可能是转录后修饰导致组织细胞中蛋白表达与预测大小之间的差异。
　　在MOR和OTR共转的CHO细胞由于没有生理状态下的神经体液调控，两种蛋白都可以大量表达[8]。过量表达的受体由于空间接触紧密，因此有可能形成在生理状态下不存在的二聚体。为探讨体内是否也存在MOR和OTR二聚体，本研究对大鼠脑组织进行了检测。结果表明，在大鼠脑组织内MOR和OTR也可形成二聚体。与体外细胞表达受体间二聚体相比，脑组织内的受体二聚体免疫印迹条带较弱，共转细胞和脑组织的泳道差别较大。这可能与样品制备有关，但最大可能是体外培养细胞中MOR和OTR蛋白过量表达，既反映了受体二聚化，又造成了少量的假阳性，所以需要进一步在MOR和OTR蛋白表达量正常的大鼠脑组织中确认受体的二聚化。

转贴于 　　大鼠脑组织裂解液IP实验显示MOR和OTR二聚体的存在，表明MOR和OTR二聚体在脑内自然存在，并可能类似其他GPCRs受体二聚体，形成功能上不同于单个受体的新的功能单位[9]。有独特的药理学特性、配体结合能力、受体后信号转导和内化特点。
　　荧光共振能量转移，是利用与供、受体荧光蛋白融合表达的分子间结合使得供、受体荧光蛋白间距离小于10 nm，这样在供体受激发时，受体可以通过吸收供体发出的能量而激发[10]。实验中通过FR均值的比较可见，MOR和OTR共转组FR均值明显高于对照组，表明有较强的FRET现象发生。FRET受培养细胞中转染蛋白表达量的影响，荧光蛋白的表达量越高，越容易因空间距离小而发生FRET。荧光显微镜下观察，空荧光载体转染CHO细胞后荧光强度比相同浓度实验组共转染细胞的荧光强度要高，这是因为重组质粒的启动子是外源性插入片段自带的，并且表达的融合蛋白也远大于单纯的荧光蛋白。但是在融合荧光蛋白表达量非常低时FRET信号会相当弱，FRET荧光显微镜就不能采集到信号。为了保证检测到融合蛋白的FRET信号，质粒浓度要求比较高， 这样空载体的质粒浓度会相对偏大，导致单纯荧光蛋白表达量较高，使得阴性对照组FR均值偏大，但此时实验组的FR值为阳性则更有意义。
　　生物化学和生物物理学的方法都表明了MOR和OTR可以形成异源性二聚体，但有关MOR和OTR受体二聚体的很多问题有待解决，如MOR和OTR 的结合方式是氢键、共价键还是离子键，MOR和OTR间的结合是否受配体的影响，还有两种受体是否可在一种配体的激活下同时发生内化，只有弄清了这些问题才能更好地解释MOR和OTR二聚体在体内的生理意义。

参考文献

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