关于人类不同年龄段腰椎间盘组织细胞凋亡及其调控蛋白Bcl2和Bax的表达

【摘要】 目的 探讨细胞凋亡及其调控蛋白在人类不同年龄段椎间盘组织退变中的作用及其可能存在的基因调控机制。方法 对0～58岁不同年龄段正常人腰椎间盘髓核细胞的形态结构进行苏木精伊红染色光镜观察、TUNEL细胞凋亡检测、Bcl2和Bax蛋白免疫组织化学染色。结果 从胚胎后期开始，椎间盘髓核细胞数量随年龄增长而逐渐减少，到老年阶段髓核细胞的数量已经很少(H=95.123，P&<0.05)。从胚胎后期到成年，TUNEL阳性细胞率随年龄增长而逐渐降低，并降到整个生命过程中的最低点；继之，TUNEL阳性细胞率又逐年升高(F=205.391，P&<0.05)。自胚胎后期开始，Bcl2蛋白就开始有较高水平的表达，但呈现逐年下降的趋势(F=81.385，P&<0.05)。Bax蛋白在胚胎后期即呈现较高水平表达，随年龄增长其表达水平逐渐降低(F=102.134，P&<0.05)；到成年后，Bax蛋白表达水平又有所升高，但不明显。结论 在整个生命过程中，随年龄增长大量腰椎间盘髓核细胞发生凋亡，细胞数量明显减少。Bcl2蛋白可能参与了椎间盘细胞凋亡的调节，但表达水平较低，不能阻止细胞凋亡的发生。Bax蛋白的表达可能参与了整个生命过程中椎间盘髓核细胞的凋亡。
【关键词】 椎间盘 髓核细胞 细胞凋亡 蛋白质Bcl2 蛋白质Bax
［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate apoptosis of intervertebral disc cells and gene regulation in different ages of human body.MethodsThe intervertebral disc cells in different ages of human body were examined by hematoxylin and eosin staining， TdTmediated dUTP nicklabeling (TUNEL) and Bcl2， Bax protein immunohistochemical method.ResultsFrom the later stage of embryo， the number of nucleus pulposus cells reduced gradually with the age， and the cells became few in the oldage stage (H=95.123，P&<0.05). From the later stage of embryo to adulthood， the rate of TUNEL positive cells reduced gradually to the lowest in the whole life， then increased with the age (F=205.391，P&<0.05). A higher expression of Bcl2 protein could be seen in the later stage of embryo， but reduced gradually with the age (F=81.385，P&<0.05). From the later stage of embryo to adults， the rate of Bax protein positive cells reduced gradually with the age (F=102.134， P&<0.05); then the rate of Bax protein positive cells increased a little， year by year， from adults to oldage.ConclusionIt is through apoptosis that nucleus pulposus cells of intervertebral disc die， the number of cells decrease obviously. Apoptosis of nucleus pulposus cells might be Baxdependent， and because of the lower expression， Bcl2 can not obstruct the occurrence of apoptosis.
　　［KEY WORDS］ intervertebral disc; nucleus pulposus cells; apoptosis; protein Bcl2; protein Bax
　　自20世纪70年代以来，随着对细胞凋亡研究的逐渐深入，人们发现细胞凋亡可能参与椎间盘组织退变的病理生理改变，并指出细胞凋亡是退变椎间盘组织中细胞数量减少的主要原因[1]，并有试图通过影响椎间盘细胞凋亡来逆转椎间盘组织退变的报道[2]。但对人随着年龄变化的椎间盘细胞功能以及在不同年龄段椎间盘细胞凋亡的情况，尚缺乏全面可靠的研究。Bcl2是目前最受重视抑凋亡基因的代表，促凋亡基因的代表为Bax，组织中Bcl2和Bax的比例可决定细胞凋亡的敏感性[3]。因此，研究不同年龄段椎间盘细胞凋亡与Bcl2、Bax基因表达之间的关系，对揭示椎间盘组织退变的机制具有十分重要的意义。本研究通过对人类不同年龄段正常腰椎间盘组织髓核细胞进行苏木精伊红(HE)染色观察、细胞凋亡的TUNEL检测及Bcl2、Bax蛋白免疫组织化学检测，研究人类不同年龄段椎间盘细胞凋亡的规律，探讨椎间盘细胞凋亡与Bcl2、Bax 蛋白表达之间的关系，为深入研究椎间盘组织退变的机制以及可能的生物学防治方法提供实验依据。现将结果报告如下。
1 资料和方法
　　1.1 实验分组
　　取0～58岁新鲜健康椎间盘L4或L5（尸体，死亡后1～4 h）20例，分为0～10 岁、20～30岁、31～40岁、41～50岁和50岁以上5个实验组，每组4例，无性别限制。
　　1.2 取材及处理
　　取出的椎间盘组织冲洗后立即放入40 g/L多聚甲醛溶液固定3周，常规石蜡包埋。切片时，每4张连续切片为一组，切片厚度7 μm，分别行HE、TUNEL和Bcl2、Bax蛋白免疫组织化学染色。
　　1.3 观察方法
　　使用OLYMPAS BX50多功能显微镜观察组织，然后把镜下的图像用摄像机接转至彩色监视器屏幕上，计数细胞数。当细胞剖面压在边线时，只计算压上边线和左边线者，压下边线和右边线者不计入。每组选取4张切片，每张切片在高倍镜下随机选取5个视野，计数单位面积内髓核细胞的数量，结果用±s表示，将所得数据进行单因素方差分析。运用显微图像分析系统（VIDAS）测定椎间盘髓核细胞内免疫反应产物的平均吸光度值。在每张切片上随机选出5个视野进行计算机显微图像分析，测得其平均吸光度值，结果用±s表示，并对所得数据进行单因素方差分析。
　　2 结　　果
　　2.1 HE染色观察
　　在婴幼儿及儿童时期，髓核细胞数量较多，以长椭圆形或梭形脊索细胞为主，可见少量纤维样细胞。随着年龄的增长，脊索细胞逐渐减少，并开始出现软骨样细胞。至成年后，脊索细胞几乎完全消失，在髓核中以软骨样细胞为主，脊索样细胞偶见。此后，伴随着年龄的增长，软骨样细胞的数量呈进行性减少，50岁以后髓核内细胞数量已经很少(H=95.123，q=7.651～10.243，P&<0.05)。见表1。

2.2 TUNEL检测
　　在婴幼儿及儿童时期椎间盘髓核细胞的数量较多，TUNEL检测阳性细胞的百分率较高，阳性颗粒的平均吸光度值亦很高。至成年以后，髓核组织TUNEL阳性细胞的百分率及阳性颗粒的平均吸光度值较儿童时期有所降低。此后，随年龄增长髓核细胞的数量持续下降，而TUNEL检测阳性细胞的百分率和阳性颗粒的平均吸光度值又逐渐增高。见表1。与相邻前一组比较，无论是TUNEL检测阳性细胞的百分率还是阳性颗粒的平均吸光度值，差异均有显著性（F=126.415、205.391，q=6.617～10.448，P&<0.05)。 表1 人类不同年龄段腰椎间盘髓核细胞HE染色细胞数、TUNEL检测阳性细胞百分率及平均吸光度值
　　2.3 Bcl2免疫组织化学染色
　　从胚胎时期开始，随着年龄的增长Bcl2蛋白免疫阳性细胞的百分率基本上呈持续降低的趋势；阳性颗粒的平均吸光度值随年龄的增长呈现同样的变化趋势(F=81.385、320.176，q=1.471～22.805，P&<0.05)。见表2。
　　2.4 Bax免疫组织化学染色
　　在婴幼儿及儿童时期，Bax免疫阳性细胞百分率和阳性颗粒的平均吸光度值均较高，然后随年龄的增长Bax免疫阳性细胞百分率和阳性颗粒的平均吸光度值开始下降；到成年后二者又开始逐年增高(F=102.134、318.609，q=4.727～46.139，P&<0.05)。见表2。 表2 人类不同年龄段腰椎间盘髓核细胞Bcl2、Bax免疫组化染色阳性细胞率及平均吸光度值
3 讨　　论
　　目前，人们对椎间盘组织发生退变的详细机制尚不十分明了。自细胞凋亡的概念提出以来，众多学者对其进行了深入的研究，并猜测细胞凋亡可能参与了椎间盘组织退变的发生。根据本实验结果，自胚胎后期开始就有大量髓核细胞的胞核表现为TUNEL反应阳性，随着年龄增长TUNEL阳性反应的细胞数逐渐减少，阳性反应越来越强，但细胞凋亡率却呈现如下趋势：自胚胎后期开始，细胞凋亡率处于较高水平，并随年龄增长而逐渐降低，到成年时降到最低水平；此后，随年龄增长细胞凋亡率缓慢增高，但凋亡率不能达到胚胎后期及婴幼儿的水平。这一时程基本与光镜下HE染色所显示的髓核细胞死亡的时程相似，提示椎间盘髓核细胞的死亡是以凋亡的形式进行的，这与GRUBER等[3]的研究结果相一致。随着时间推移，大量髓核细胞以凋亡的形式死亡，细胞活性降低，分泌功能低下，导致髓核的结构和组成成分发生改变，椎间盘组织发生退变。
　　细胞凋亡是由基因调控的过程，其发生与否同许多基因的表达、基因表达的调控以及不同基因表达之间的相互作用有着密切的联系[4]。根据本实验研究结果，结合其他学者的报道，可以认为：即自胚胎后期开始就有大量椎间盘髓核细胞发生凋亡，在整个生命过程中椎间盘髓核细胞的减少是通过凋亡的形式实现的；Bcl2和Bax参与了整个生命过程中椎间盘髓核细胞的凋亡，并随年龄的增长呈现不同的变化趋势。关于Bcl2、Bax蛋白在细胞内表达的意义及其与细胞凋亡的关系，目前已有许多报道[5]，在此不再赘述。只是目前，对于Bcl2和Bax在椎间盘细胞内的详细作用机制、Bax蛋白接受何种信号以及还有哪些细胞因子参与了此过程等问题尚有待于进一步的研究，揭示这一系列问题将为椎间盘退变的基因治疗提供相应的生物学基础，使从根本上预防或逆转椎间盘组织退变成为可能。
【参考文献】
[1]LOTZ J C， CHIN J R. Intervertebral disc cell death is dependent on the magnitude and duration of spinal loading[J]. Spine， 2000，25:1477.

[2]夏玉军. 转染外源性转化生长因子β基因对兔椎间盘髓核细胞凋亡的影响[J]. 青岛大学医学院学报， 2003，39:140.

[3]GRUBER H E， HANLEY E N. Analysis of aging and degeneration of the human intervertebal disccomparison of surgical specimens with normal controls[J]. Spine， 1998，23:751.

[4]PARK J B， CHANG H， KIM K W. Expression of Fas ligand and apoptosis of disc cells in herniated lumber disc tissue[J]. Spine， 2003，28:61821

[5]WYLLIE A H. The genetic regulation of apoptosis[J]. Curr Opin Genet Dev， 1995，5:97.