人发角蛋白人工神经的免疫学分析

【摘要】 目的 探讨人发角蛋白（HHK）人工神经组织相容性，为周围神经（PN）缺损寻求理想的移植修复材料。方法 54只健康成年SPF级雄性Wistar大白鼠随机分为A、B、C三组。A组为实验组，B、C组为对照组。将各组大白鼠右侧胫神经切除10 mm，A组用人发角蛋白人工神经桥接；B组将切除神经倒转180°原位缝合；C组用A组大白鼠所切除的胫神经桥接。术后2、8、16周各组随机取6只大白鼠，采血检测免疫球蛋白IgA、IgM、IgG，补体C3、C4，T淋巴细胞亚群及T淋巴细胞转化率。结果 术后2、8、16周各组血液免疫学指标比较，A、B两组之间均无显著性差别（F=17.56～571.34，q=0.00～2.09，P&>0.05），C组与A、B两组比较均有显著性差别（q=7.04～41.47，P&<0.01）。结论 人发角蛋白人工神经具有良好的组织相容性，是修复PN缺损较为理想的移植材料。
【关键词】 发 角蛋白 人工神经 修复外科手术 组织相容性 免疫学
［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the histocompatibility of humanhair keratin (HHK) artificial nerve and offer an ideally transplanted material for repairing the defect of peripheral nerve (PN).MethodsFiftyfour Wistar rats were randomly pided into three groups: group A， experiment group; group B and group C， control groups. The right tibial nerves of the rats were removed to create a 10 mm gap. The gaps in group A were bridged with the HHK artificial nerve， and other two groups with the nerve of its own or the homologous nerve (group C). The blood samples were taken on 2， 8 and 16 weeks after operation to detect IgA， IgM， IgG， C3， C4， and T lymphocyte subgroup and T lymphocyte transformation.ResultsThe immunological parameters between rats of groups A and B showed no statistical difference (F=17.56-571.34，q=0.00-2.09，P&>0.05). The difference between groups C and A or B was statistically significant (q=7.04-41.47，P&<0.01).ConclusionHumanhair keratin artificial nerve， with its favourable histocompatibility， is an ideal graft material for peripheral nerve repair.
　　［KEY WORDS］capilli; keratin; artificial nerve; reconstructive surgery; histocompatibility; immunology
　　人发角蛋白（HHK）是由青岛大学医学院附属医院骨科与广州南方医科大学生化研究室共同研发的一种天然生物性材料，初步的实验研究已经证明，该材料可降解，组织相容性好，可诱导自体组织形成[1，2]，且来源广泛，价格低廉，由其制成的人工腱已经应用于临床[3，4]，取得了较理想效果。但该系列的人发角蛋白人工神经在桥接周围神经(PN)缺损后的免疫学研究国内外尚未见报道。本实验着重从免疫学角度研究人发角蛋白人工神经在桥接PN缺损后的抗原性及组织相容性，为人发角蛋白人工神经修复PN缺损提供动物实验依据，为PN缺损修复寻求较为理想的移植材料。
　　1 材料与方法
　　1.1 动物及材料
　　健康成年SPF级雄性Wistar大白鼠(青岛市实验动物中心提供)54只，体质量（250±10）g；快速降解HHK、生物膜（青岛大学医学院附属医院骨科与广州南方医科大学生化研究室提供）。
　　1.2 主要试剂及仪器
　　单克隆抗体（英国朗道公司），植物血凝素（SigmaAldrich公司），流式细胞仪（FACS Calibur，美国BD公司），自动生化分析仪（AQ 640，奥林巴斯），手术显微镜（ASOM4A，上海生产）。
　　1.3 人发角蛋白人工神经制备
　　快速降解HHK 36根，外包一层生物膜，制成长度为10 mm，直径约1 mm人工神经材料，经高温消毒备用。
　　1.4 模型建立
　　将54只大白鼠随机分为3组，每组18只，其中A组为实验组，B、C组为对照组。100 g/L水合氯醛（350 mg/kg）对大鼠进行腹腔注射麻醉。麻醉成功后取俯卧位将大白鼠固定于操作台上，取右下肢后外侧切口，显露坐骨神经及其分支，确认胫神经，切除一段长10 mm胫神经，在16倍手术显微镜下，A组大鼠用人工神经材料桥接胫神经，两断端各用 90显微缝线将人工神经生物膜和神经外膜间断缝合6针。按以上方法，C组大鼠取A组大鼠之切除胫神经进行桥接。B组大鼠将切除神经倒转180°，桥接于断端。术后所有大鼠均腹腔注射青霉素4万单位预防感染。
　　1.5 术后取材及检测
　　分别于术后2、8、16周各组随机抽取6只大鼠，按照前法腹腔麻醉后，于左颈前分离左颈总动脉，取血3 mL置EDTA抗凝管内，送实验室立即进行免疫荧光染色和固定，标记后即上流式细胞仪行T淋巴细胞亚群检测。取血2 mL进行体外培养，用PHA进行刺激，进行T淋巴细胞转化试验。取血6 mL 置干燥管内，静置后送实验室采用免疫速率散射比浊法行免疫球蛋白IgA、IgM、IgG及补体C3、C4检测。
　　1.6 统计学处理
　　各组数据采集整理后，以均数±标准差表示，应用SPSS 11.0统计软件进行方差分析。
　　2 结　　果
　　术后2、8、16周各组大鼠血液免疫学指标比较，A、B两组之间无显著性差别（F=17.56～571.34，q=0.00～2.09，P&>0.05），C组与A、B两组比较均有极显著性差别（q=7.04～41.47，P&<0.01）。见表1～3。表1 术后2周各组免疫指标检测结果（表2 术后8周各组免疫指标检测结果表3 术后16周各组免疫指标检测结果
　　3 讨　　论
　　3.1 PN损伤修复的发展
　　PN损伤常导致神经断端的缺损，两神经断端存在间隙不利于再生轴突的生长，直接缝合神经两断端往往困难，且吻合端张力较大，影响其血液供应及修复[5]，寻求理想的桥接材料成为PN损伤修复的关键。自体神经富含雪旺细胞和神经束结构，被公认为是修复神经缺损的黄金标准[6]，但自体神经移植必然伴有供区的功能受损，而且可供移植的神经来源有限。异体神经移植由于移植后免疫排斥反应不能解决，并且可能引起疾病的传播以及医学伦理方面的障碍，至今尚未广泛用于临床。随着组织工程学迅速发展，使用神经移植替代物(人工神经)来代替自体神经移植，多年来成为人们研究的重点。

转贴于 FAWCETT等[7]认为理想的神经桥接体应具备的条件：①再生轴突能长入并通过移植体到远端部位；②通过移植体的轴突具有正常的直径、髓鞘和传导动作电位；③没有抗原性；④能较快地获得血运；⑤移植体再生轴突排列有序，确保准确到达靶组织或靶器官。人发中的主要成分为角蛋白，以微丝和基质的形式存在，经一系列物理化学处理后，能软化解聚，并保持人发的力学特性。解聚的角蛋白较容易被组织降解和吸收，可根据需要控制其降解速度。用HHK制成的生物材料在体内可降解吸收，不产生免疫排斥反应，并可诱导自体组织的形成。
　　但HHK在桥接PN神经缺损后对机体免疫影响，尚缺乏完整的动物实验依据，限制了其进一步应用到临床修复PN缺损。
　　3.2 本实验设计的科学性和可靠性
　　本实验用人发角蛋白人工神经桥接大白鼠胫神经缺损，进行免疫学研究，并与自体神经和异体神经相对照，评价其组织相容性。机体全身免疫分为体液免疫和细胞免疫，免疫球蛋白IgA、IgM、IgG和补体C3、C4在血液中含量较高，在机体的体液免疫中起着重要作用。CD+4代表T辅助细胞，CD+8代表T抑制细胞，CD+4/CD+8比值的变化可以判断细胞免疫功能，反映免疫调节功能变化。T细胞转化试验主要用于体外检测T细胞的生物学功能，反映机体的细胞免疫水平。
　　坐骨神经是建立PN损伤与修复的良好实验模型，常用的方法是切断坐骨神经主干。以往实验中发现，切断坐骨神经主干后，同时切断了前往其所支配的组织器官的神经纤维，远端的大部分肢体失去了神经营养和皮肤感觉。术后远端肢体陆续出现皮肤溃疡，部分用来实验的大白鼠甚至自食或相互咬掉实验侧肢体，使实验失败。而且经久不愈的肢体溃疡也严重影响实验材料检测的准确性，尤其对体液免疫和细胞免疫指标检测会产生偏差，影响实验数据的准确性。本实验显示成年大白鼠胫神经由坐骨神经分出至远端分叉处长度超过15 mm，解剖清晰，和腓总神经比较形态差别明显，易于辨认，切断坐骨神经分出的胫神经可以完全阻断腓肠肌的神经支配，最大限度地保存肢体其他组织的神经营养和皮肤感觉，尽可能避免大白鼠出现肢体溃疡及撕咬肢体现象，保证实验模型建立的成功。同时，术后早期预防性应用一次抗生素，可防止切口感染，提高了实验数据的准确性。
　　3.3 人发角蛋白人工神经良好的组织相容性
　　植入物进入机体后，血液免疫球蛋白、C3、C4、CD+4/CD+8及T淋巴细胞转化率水平升高，往往提示发生排斥反应。本实验结果显示，术后2、8、16周各组大鼠免疫球蛋白IgA、IgM、IgG及补体C3、C4检测结果比较，A、B两组间差别均无显著意义（P&>0.05），C组与A、B两组的差别均有极显著意义（P&<0.01）。各项免疫指标水平A组与B组相近，而C组各项指标均明显高于A、B两组。A、B两组各项免疫指标术后2周处于略高水平，这可能与手术损伤有关，术后8、16周，随着时间延长逐渐下降，而C组各项免疫指标虽在术后2周或8周后亦有下降趋势，但一直持续在较高水平。本实验结果表明，人发角蛋白人工神经桥接大鼠胫神经缺损后，无论体液免疫指标还是细胞免疫指标，人发角蛋白人工神经与自体神经移植相似，对大鼠免疫影响小，无明显排斥反应，明显优于异体神经移植。因此我们认为，人发角蛋白人工神经对机体抗原性小，具有良好的组织相容性，是修复PN缺损较为理想的桥接材料，将有良好的临床应用前景。

【参考文献】
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[7]FAWETT J W， KEYNES R J. Muscle basal lamine: a new graft material for peripheral nerve repair[J]. J Neurosurg， 1986，65:354357.