关于β淀粉样蛋白对小胶质细胞合成一氧化氮的影响

　　　　　　　　 作者：韩笑峰 吕丽 葛汝丽 唐荣华

【摘要】 目的 探讨β淀粉样蛋白(amyloid betapeptide， Aβ)诱导小胶质细胞活化后κ轻链核因子(nuclear factorkappa B， NFκB)的表达及一氧化氮(NO)水平的变化。方法 Aβ干预纯化培养的小胶质细胞，观察其形态学变化，采用镉还原法测定NO水平，免疫细胞化学方法研究NFκB的表达。结果 500 nmol/L及1000 nmol/L Aβ干预组细胞形态呈“阿米巴样”，细胞核内NFκB的表达增加（P＜0.05），培养基中NO浓度升高（P＜0.05）。结论 Aβ激活小胶质细胞NFκB途径大量合成NO，可能参与阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease， AD)的致病过程。
【关键词】 β淀粉样蛋白 小胶质细胞 κ轻链核因子 一氧化氮 阿尔茨海默病
　　【Abstract】 Objective To study the morphological changes of microglial cell activated by amyloid betapeptide， the expression of nuclear factorkappa B increased in nucleus and the levels of nitric oxide in cultural medium. Methods Purified microglial cells were intervened by amyloid betapeptide and the morphological changes were observed . The cadmiumreduction method was used to determine the levels of nitric oxide in culture medium， immunocytochemical method to investigate changes of nuclear factorkappa B. Results There were no statistical significant differences between the experimental group of 100 nmol/L amyloid betapeptide and the control group (P＞0.05). In the experimental groups of 500 nmol/L and 1000 nmol/L amyloid betapeptide， microglial cells were bigger， the expression of nuclear factorkappa B increased in nucleus and the levels of nitric oxide were higher in culture medium than control group (P＜0.05).Conclusion The amyloid betapeptide could participate in the processes of Alzheimer’s disease by inducing microglial cells to excrete nitric oxide.
　　【Key words】 amyloid betapeptide，microglial cell，nuclear factorkappa B，nitric oxide，Alzheimer’s disease
　　阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease， AD)重要的病理特征之一是纤维状β淀粉样蛋白(amyloid betapeptide， Aβ)在神经细胞外及脑血管壁沉积形成老年斑(senile plaques， SP)。大量研究表明，Aβ的沉积在AD发病中起着关键作用，但其神经损伤的具体机制尚不完全清楚，研究提示，一氧化氮(nitric oxide， NO)可能与Aβ的神经毒性有关。本研究用Aβ干预小胶质细胞，观测κ轻链核因子(nuclear factorkappa B， NFκB)的表达以及NO水平的变化，探讨Aβ诱导小胶质细胞合成NO的机制。
　　1 材料和方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 动物：出生3 d内的Wistar大鼠，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。
　　1.1.2 试剂：DMEM/F12培养基、胎牛血清（购自Hyclone公司），Aβ140、Aβ142（购自SIGMA公司），胰蛋白酶、TritonX100（购自Amresco公司），小鼠抗大鼠CD11b单克隆抗体（购自Serotec公司），兔抗NFκB p65 多克隆抗体（购自SANTA CRUZ公司），抗小鼠及抗兔SP试剂盒和DAB显色试剂盒（均购自北京中山生物技术有限公司）。
　　1.2 方法
　　1.2.1 小胶质细胞分离、培养：在无菌条件下取出新生Wistar大鼠的大脑，剥离脑膜，取大脑皮层，剪成0.5 mm3碎块，加入1 ml 0.125%胰蛋白酶室温消化，用100目不锈钢筛网过滤，离心，弃上清，加入DMEM/F12培养基重新悬浮细胞，接种于多聚赖氨酸包被的50 ml培养瓶中，置于37℃、含5%CO2、20%O2饱和湿度的培养箱中培养。原代混合胶质细胞培养7～9 d后，在37℃恒温摇床上以250 r/min振速摇动处理2.5 h，将细胞悬液接种到已放置盖玻片的培养皿中，37℃培养1 h，弃未贴壁细胞，加新鲜培养基，培养5～7 d即可使用。用免疫细胞化学方法标记其特异性抗原CD11 b进行细胞纯度鉴定，小胶质细胞比例占90%以上即符合要求。
　　1.2.2 Aβ的“老化（aged）”：用无菌三蒸水将Ａβ稀释成 0.5×105 nmol/L，37℃孵育 1周，使其变为聚集状态的Ａβ［１］。
　　1.2.3 小胶质细胞的干预：培养皿中分别加入不同浓度的“老化”Ａβ140或Ａβ142，对照组则不加Ａβ，继续培养24 h。收集培养基，-80℃保存，备测定NO浓度。细胞爬片用甲醛固定15 min，-20℃保存备用。
　　1.2.4 免疫细胞化学染色：免疫细胞化学染色采用SP法。第一抗体小鼠抗大鼠CD11b单克隆抗体的稀释度为1∶1 000，兔抗NFκB p65 多克隆抗体的稀释度为1∶200，以PBS替代一抗作阴性对照。联苯二胺（DAB）显色。NFκB p65免疫细胞化学结果判断：在高倍视野下行细胞计数，细胞核有棕褐色颗粒着色为阳性，无棕褐色颗粒着色为阴性。并根据Handel等［2］的分级标准半定量：-(＜5% )，+(5%～25% )，++(26%～ 49% )，+++ (≥ 50 % )。
　　1.2.5 NO测定：采用Cortas NK等［3］的镉还原法测定NO浓度。用不同浓度的KNO3做阳性标准管，无标本管做空白对照。用721分光光度计测定OD值。计算标准曲线并换算NO浓度。
　　1.2.6 统计学处理：数据资料应用SAS 6.12版软件进行统计学分析。等级计分结果比较采用Ridit分析。计量数据以均数±标准差（x±s）表示，统计分析采用多个均数之间两两比较的SNK检验。
　　2 结果
　　2.1 小胶质细胞鉴定及Aβ干预后其形态学变化 经CD11b免疫细胞化学染色，胞膜及胞浆染色的细胞即为小胶质细胞，其纯度达92%(图1A，1B)。正常培养的小胶质细胞的形态特征为：胞体小，呈椭圆形或三角形，具有伸向各个方向的细小突起 (图1A)。Aβ干预后小胶质细胞胞体变大，形态不规则。部分细胞有片状突起或伪足，呈“阿米巴样”(图1B)。
　　( → )所标记为小胶质细胞
　　图1A 正常培养的小胶质细胞CD11b免疫
　　细胞化学反应及其形态(×400)图1B Aβ干预后小胶质细胞CD11b免疫
　　细胞化学反应及其形态(×400)
　　2.2 Aβ干预后NFκB的表达变化 NFκB免疫细胞化学染色后，对照组细胞胞浆染色，而Aβ干预组细胞除胞浆外，胞核及核周区域亦出现染色(图2A，2B)。等级计分Ridit分析，Aβ142 和Aβ140 500 nmol/L干预组与对照组比较差异有显著意义 (P＜0.05)，1 000 nmol/L组与对照组比较差异有极显著意义 (P＜0.01)，而100 nmol/L组与对照组比较差异无显著性(P＞0.05)(表1)。相应浓度的Aβ142干预组与Aβ140干预组比较差异无显著性 (P＞0.05)。
　　图2A 对照组小胶质细胞NFκB p65免疫
　　组化反应(×400) 图2B 1 000 nmol/L Aβ42干预后小胶质细胞
　　NFκB p65免疫组化反应(×400) 表1 NFκB p65免疫细胞化学结果及Ridit分析
　　2.3 Aβ干预后培养基中NO含量变化 100 nmol/L Aβ140、500 nmol/L Aβ140、100 nmol/L Aβ142干预组培养基中的NO含量与对照组比较无显著差异(P＞0.05)；500 nmol/L Aβ142、1 000 nmol/L Aβ140干预组培养基中的NO含量与对照组比较显著增高(P＜0.05)；1 000 nmol/L Aβ142干预组培养基中的NO含量增高与对照组比较有极显著意义 (P＜0.01) (表2)。相应浓度的Aβ142干预组与Aβ140干预组比较无显著差异(P＞0.05)。表2 Aβ干预后培养基中的NO含量比较

3 讨论
　　研究证明，NO参与了AD的病理过程并发挥重要的作用［4］，但Aβ诱导合成NO的具体机制尚未完全阐明，Guo等［5］报道其与NFκB的信号转导和基因转录密切相关。
　　本实验结果显示， Aβ干预小胶质细胞后，核内NFκB的表达增加，提示NFκB被激活。NFκB是普遍存在于细胞浆中的一种快反应转录因子，调控细胞因子、趋化因子、免疫受体、转录因子、氧化应激相关酶以及急性期蛋白等多种靶基因，参与炎症和免疫反应、细胞周期控制与分化、细胞凋亡、感染及应激反应，其在AD的发病机制中具有重要的作用［6］。静息状态下，NFκB与NFκB抑制蛋白（IκB）单体结合，以非活性状态存在于胞浆中。在外界因素的作用下，IκB 快速降解，有p50和p65两个亚单位组成活化状态的NFκB迅速转移入胞核，与靶基因的κB序列结合启动基因转录。
　　目前认为，小胶质细胞表面有多种Aβ结合的受体：清道夫受体(class A scavenger receptor， SR)、晚期糖化终末产物受体(receptor for advanced glycation endproducts， RAGE)及甲酰基蛋白受体（formyl peptide receptorlike 1，FPRL1）等，Aβ与受体结合后启动第二信使激活NFκB途径［7～9］，而NFκB如何被激活尚不清楚。
　　可诱导的一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase， iNOS)基因是NFκB调控的一个重要靶基因，被Aβ激活的NFκB转移入核，结合于iNOS的启动子区的NFκB反应元件，诱导iNOS大量的表达，NO产生增多［10］。此与本实验结果一致，低浓度(500～1 000 nmol/L)Aβ可激活小胶质细胞致NO产生增多。
　　NO在中枢神经系统的神经传导、记忆和空触可塑性中发挥重要的生理功能，而过量的NO可通过多种途径损伤膜性结构、蛋白质及DNA，导致神经元坏死或凋亡［11］；亦可介导和放大氧化应激、炎症级联反应，进而选择性损害与学习记忆有关的神经元，促进SP的形成［12］，使AD病理变化进行性发展。可以推论，Aβ的神经毒性机制之一是通过激活NFκB诱导iNOS过表达而产生超生理剂量的NO来发挥的。
　　因此，小胶质细胞的AβNFκBiNOSNO途径，可能在AD过程中起着重要的作用，对此途径进行深入研究，可进一步揭示AD发病机制以及为AD的临床治疗提供理论依据。
【参考文献】
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