【摘要】大鼠足垫皮肤存在角质层厚、组织层次复杂等特点，给石蜡切片的制作增加了很大的难度。我们利用大鼠足垫为毛囊诱导的对象，制作了大量的大鼠足垫石蜡切片，并进行相应的免疫组化实验，摸索出许多制作大鼠足垫石蜡切片的经验，藉此介绍以期作为相关研究者的参考。
【关键词】大鼠；足垫；石蜡切片制作
皮肤因其致密的角质层、复杂的组织层次、且各层次之间的密度差别非常大，因而成为皮肤病理科的难题之一。本课题组长期应用大鼠足垫作为毛囊诱导的对象，因实验要求动物标本的取材的需覆盖整个足垫且需深达肌层，使足垫皮肤石蜡切片的制作较普通皮肤切片难度大大提高。我们在长期的研究中积累了大量的经验，现将具体的制作过程及体会介绍如下。
1材料与方法
1.1材料处理与固定
1.1.1材料来源及处理:成年SD大鼠，雌雄不限，实验组用9＃针头自足后跟进针，将体积0.1ml的人头皮毛乳头细胞微囊注入足垫皮下，观察到局部有皮丘形成后，迅速退针并以生物胶封闭进针口。6周后足垫皮肤取材行组织学检查。该实验的目的是观察毛乳头细胞微囊是否能诱导大鼠足垫无毛区形成毛囊结构，以及毛乳头细胞微囊的变化，因注射的层次在皮下组织与肌层之间，所以取材时要将整个足垫从表皮至肌层同时剪下，且在包埋之前不能剪碎以避免微囊漏出影响结果观察。
1.1.2标本固定:大鼠以乙醚麻醉后脱颈处死，沿足垫外周无毛区将整个足垫表皮至部分肌层剪下，大小约2.5cm×1cm×0.5cm，该体积较正常取材要求的1cm×1cm×0.2cm明显增大，但我们大量的实验证明这样的体积并不影响固定液的渗透。因这些标本后期需进一步行免疫组化检测，故固定时采用4%多聚甲醛以保护组织抗原，固定液的配制严格按照文献介绍[1]，配制置后于4℃保存，一般使用期一个月，避免其PH值等参数改变影响固定效果。标本剪下前先用生理盐水插去表面的污物，剪下后插去血液立即投入固定液中，固定时间为4h，固定时间过长标本将变脆，固定时间过短影响固定效果。固定液一般要求为标本的5倍，但我们为后期制作方便将每个标本分别放置于包埋框中，所以固定液的量一般高出包埋框2-3cm，即实际使用的固定液大大一般是标本体积的20倍左右，实际证明，这样的固定效果非常好，弥补了标本过大给固定带来的影响。固定后流水冲洗24小时以保证把固定液充分冲洗干净，避免残存的固定液影响免疫组化结果。
2脱水与透明
2.1脱水 一般皮肤标本的脱水从70%酒精开始[1，2]，但我们前期实验结果显示，70%酒精可能导致标本出现过度脱水现象，损伤皮肤组织内部结构，尤其是皮下组织的原貌，影响标本观察，因此我们采用从50%酒精开始的方法，每次脱水都严格按照程序进行：50%酒精3h，75%酒精过夜，85%酒精2h，95%酒精2h，100%酒精Ⅰ1h，100酒精Ⅱ1h。 梯度酒精每两周按梯度更换一次，以保证组织脱水的效果。
2.2透明:为保证充分透明，标本分别在二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ里透明各20min。这个时间标本刚好完全透明，又不会与二甲苯过度作用而变脆。
二甲苯的更换需根据实际情况定，因为频繁更换可能导致第一缸的二甲苯浓度过高使标本变脆，影响后期超薄切片的制作；长时间不更换又可能影响透明效果，染色后可能出现黑色沉淀。我们的经验是，一旦观察到二甲苯变浑浊，即将第二缸换到第一缸，只更新第二缸，必要时在第一缸中加入少许的无水乙醇，以保护组织。 转贴于 3浸蜡和包埋
3.1浸蜡:皮肤标本比较脆且硬，切片制作难度比较大，因此，浸蜡是否完全直接影响蜡块制作的成功与否，我们长期摸索的经验是慢工出细活，要分三缸浸蜡，慢慢除去标本中的二甲苯，使蜡完全渗透。其步骤如下：石蜡Ⅰ(50%石蜡+50%二甲苯)1h，石蜡Ⅱ1h，石蜡Ⅲ2h。温度严格控制在64℃～66℃。更换蜡缸时应尽量不要将组织内含有的二甲苯带到下一缸蜡中去。
3.2包埋:包埋用的石蜡要新鲜，不含杂质。为能更好地观察足垫皮肤全层的组织结构，包埋前需先将组织块剪成4-5小块，包埋时统一将剪切面竖着包埋，这样切片时才能观察到皮肤的纵切面。这里有一个小技巧：在包埋器内先注入少许溶化的蜡，待蜡在半凝的状态下，用镊子迅速夹起需要包埋的组织，像插秧一样插进半凝的蜡中，这样既能保证剪切面能立起来，又能避免碰倒已排好的组织，组织排好后再加入足量的蜡。
组织块的保存也有一定的技巧。像南方空气湿度比较大，蜡块容易被虫蛀，故少量的标本或非常重要的蜡块一般置于4℃冰箱保存，但对于我们这些动辄上百个且需要分类保存的标本放冰箱很占用空间。我们采用切片盒或空纸盒分类标记，然后用整理箱的保持的方法效果非常好，遇到春天空气湿度非常高时再放一些吸湿包，这样的保持方式已延续8年，蜡块仍完好。
4切片
切片前先把蜡块放在冷冻台或4℃冰箱中冷冻15分钟再固定在持蜡器上，调整好切片刀与蜡块的距离，调整切片厚度一般厚度为3-5μm。先进行修片修完片后重新把蜡块放入冷冻台或-20℃冰箱中冷冻15分钟再进行切片。连续旋转转轮会切出一条连续的蜡带，左手用毛笔将蜡带轻轻托起，牵引蜡带向前拉，至一定长度后用镊子和毛笔将蜡带取下放在44℃水中摊平再捞片。捞片位置以中间为好。切片的速度要快，摊捞片时间不能太长以免角质层与皮下组织分离。用于普通组织学检查的石蜡切片的厚度一般为4～10μm，而该厚度的切片用于做免疫组化时常出现脱片现象，经调整蜡片厚度至2～3μm后组织脱落现象大大减少，但皮肤的超薄切片对操作者要求比较个高，需要长时间的练习才能完成。
5讨论
石蜡切片制作方法是科研中最常用的研究方法之一，看似简单，但要针对自己的标本做出一张完美的切片仍然需要长时间的摸索，尤其对于一些复杂的标本，如本文所用的大鼠足垫皮肤，还有一些如软骨等特殊的组织，都需要不同的处理程序以达到最佳的效果。而且，石蜡切片的制作是一个连续的流程，需要操作者熟悉每一个步骤的意义及可能的结果，才能随时调整实验方案。其次，操作者还需要有认真负责的态度，严格控制每个步骤的时间，这样做不但保证蜡块的质量，也保证所有的实验条件都相同，使最终一些要求定性、定量的实验结果可信度高。此外，许多初学者都是拿着别人的实验流程就埋头往下做，严格按照流程往往需要半夜更换脱水剂，或者遇到这种情况时随意更改实验流程，往往影响最终的实验结果。我们的经验是每次都将取材固定的时间控制在上午10点，然后固定到当天下午2点，冲水至第2天下午2点，50%酒精脱水至5点换75%酒精过夜，这样的流程刚好将整个实验时间控制在上班时间段，避免休息时间的实验操作，对于工作量很大的科研者而言，时间安排是非常重要的。
总之，石蜡切片制作是一件貌似简单实则困难的工作，需要我们用心去对待。
参考文献
[1]高天文，廖文俊.皮肤组织病理学入门[M].北京:人民卫生版社，2007:2-20
[2]钟白玉，唐书谦，郝飞，等.实用皮肤病学杂志[J].2008，1（2）:73-76