作者：刘敬美，燕振国，秦萍瑛
【摘要】 目的 观察神经生长因子(nerve growth factor，NGF)在高原环境下挫伤与非挫伤视网膜同期表达水平的不同。方法 在高原环境下将实验动物分为两组，一组为眼球钝挫伤组，一组为非钝挫伤组，于1、3、7、14天分别取材，40 g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，免疫组化检测NGF，比较两组视网膜同期NGF表达水平的不同。结果 NGF在高原环境下兔眼球钝挫伤后视网膜各时间点的表达水平与同期非钝挫伤视网膜NGF的表达水平均存在差异 (125.82±1.30 vs. 124.51±0.56，117.49±1.08 vs. 120.39±0.87，121.05±0.77 vs. 118.80±0.78，126.45±0.79 vs. 124.36±1.25，P<0.05)，两组表达规律亦不相同。结论 高原低氧环境及高原环境下的眼球钝挫伤均影响视网膜NGF的表达水平。
【关键词】 神经生长因子;视网膜;高原
[Abstract] Objective To investigate the different expressions of NGF in the rabbits，contused and non-contused retina in high altitude environment.Methods pided the animals in high altitude environment to two groups:one was contused eyes and the other was non-contused，and the eyes were got at 1 d，3 d，7 d and 14 d respectively.Meanwhile，paraffin retina slices were made and the expressions of NGF in the retinas were tested with immunohistochemistry，to compare the expressions of NGF in the rabbits，contused and non-contused retina in high altitude environment.Results The expression of NGF in the contused retina was different from non-contused retina at the same time (125.82±1.30 vs. 124.51±0.56，117.49±1.08 vs. 120.39±0.87，121.05±0.77 vs. 118.80±0.78，126.45±0.79 vs. 124.36±1.25，P<0.05)，and the expression's rule was also different in two groups of retinas.Conclusion The expressions of NGF in retina are effected either in the contused retinas or the non-contused retinas in high altitude environment.
[Key words] nerve growth factor;retina;highland
神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是最早发现且目前唯一被阐明结构的神经细胞生长因子，兼有神经元营养和促突起生长的双重效应，对神经元的生长、发育、分化及再生和功能性表达均具有重要的调控作用[1，2]。已有研究表明，NGF参与影响着眼球钝挫伤后损伤视网膜的修复过程[3]，而高原地区眼球钝挫伤后的视网膜遭受着挫伤及缺氧双重因素的损伤，其表达规律必有其独特性。本实验通过在高原环境下，构建兔眼球钝挫伤和非钝挫伤模型，观察其同期视网膜NGF表达水平的不同，探讨高原低氧引起的视网膜损伤、高原环境下眼球钝挫伤引起的视网膜损伤时NGF表达的规律，为应用与NGF相关的基因和药物治疗高原低氧及高原眼球钝挫伤所引起的视网膜损伤提供进一步的理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 2个月龄北京青紫蓝兔36只72眼，普通级，健康无眼病，雌雄不限，质量2.3～2.7 kg(平均2.5 kg)，由兰州生物制品研究所提供。
1.1.2 试剂 抗-NGF(BA0611);即用型SABC试剂盒(SA1022);即用型DAB显色试剂盒(AR1022);生物素化山羊抗小鼠IgG。以上试剂均为博士德生物工程有限公司产品。
1.2 方法
1.2.1 动物分组 将36 只兔随机分为亚高原非钝挫伤组、高原非钝挫伤(单纯低氧)组、高原钝挫伤组。亚高原非钝挫伤组4只8眼，用基础饲料饲养于亚高原实验场地(海拔1 510 m)，与3天模型组兔一同处死，进行组织取材及指标测定;高原非钝挫伤组16只32眼、高原钝挫伤组16只32眼，饲养于高原实验场地(海拔3 840 m)，分1、3、7、14天，4个观察时相点，每个时相点4只8眼。
1.2.2 眼球钝挫伤模型制作 以氯胺酮25 mg/kg im麻醉后，将其头部置于高度1 m垂直固定的PVC管下，以0.33 kg的钢球，自管上端垂直落下以自由落体方式击打角膜中央1次，双眼均做，造成双眼钝挫伤模型，致伤后立即移去打击装置，把动物放回饲养笼内直至苏醒后饲养。
1.2.3 取材固定 取材时用耳缘静脉注气法处死动物，立即摘除眼球，于角巩膜缘后5 mm处开创后，固定于40 g/L多聚甲醛中1周。以矢状径切取角膜中央至视网膜后极部包括视神经的厚约5 mm的眼球组织，常规脱水、透明、石蜡包埋，连续切片6张，片厚4 μm，裱 片于经APES(多聚赖氨酸)处理的载玻片上，烘干6 h以上，备免疫组织化学染色。
1.2.4 免疫组织化学染色 切片常规脱蜡，用PBS洗3次，共15 min; 滴加30 ml/L的双氧水，室温10 min 以灭活内源性酶，蒸馏水洗3次，共15 min;滴加50 g/L BSA封闭液，室温20 min，甩去多余液体，不洗;滴加稀释的一抗(抗-NGF，稀释比例为1∶200)，置冰箱4 ℃过夜，约15～16 h;滴加二抗生物素化山羊抗小鼠IgG，室温20 min，用PBS洗3次，共6 min;滴加即用型试剂SABC(SA1022)，室温20 min，用PBS洗4次，共20 min;配制DAB显色剂(AR1022)滴在切片上，室温显色10 min，蒸馏水洗涤，终止显色，苏木素轻度复染，然后脱水，透明，封片。10×40显微镜观察，视网膜阳性表达物为棕黄色颗粒。
1.2.5 摄片与测量 用MAIS型病理学彩色图像分析仪对免疫组化结果进行图像分析、摄片、测量。摄片时条件不变，每张照片的背景光强度调为一致。在每张切片各取一相似大小的包括视网膜全层的目标面积，然后以同一确定的灰度来测定视网膜表达NGF后的目标视网膜平均灰度值(mean gray，MG)数据(灰度值为阳性表达物表达的强弱，灰度值越小，表达越强，反之亦然)。
1.2.6 统计学处理 用SPSS 10.0分析统计软件分别对视网膜NGF的表达平均灰度值(x±s)进行单因素方差分析，比较进行t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 亚高原非挫伤组视网膜NGF的表达情况 NGF主要在视网膜的外界膜、外丛状层、内丛状层、神经节细胞层表达，外核层和内核层有少量表达。
2.2 高原非挫伤组视网膜NGF的表达情况 与亚高原非挫伤组相比较，高原环境下1天与14天，NGF在视网膜的表达水平无明显差异(P>0.05)，而在3天与7天时有明显差异(P<0.01)，见表1。高原环境下1天，视网膜从外丛状层到内界膜均有NGF表达;3天时表达明显增强，从外界膜到内界膜均出现表达(P<0.01);7天时表达至高峰，表现为从外界膜到内界膜均有明显的表达，但与3天相比无显著性差异(P>0.05); 14天时表达明显回落，表现为从外丛状层到内界膜表达，与1天时表达水平相近(P=1.00)。
2.3 高原挫伤组视网膜NGF的表达情况 与亚高原非挫伤组相比较，NGF在各时相点视网膜的表达水平均有差异(P<0.05)，表1。眼球钝挫伤后1天，视网膜从外丛状层到内界膜有较微弱的NGF表达;挫伤后3天表达增强，且从外界膜到内界膜均出现表达(P<0.01);挫伤后7天表达回落，但仍表现为从外界膜到内界膜表达，与3天时相比有明显差异(P<0.01);挫伤后14天表达明显回落，表现为从外丛状层到内界膜表达，且以节细胞层表达为主，与1天时表达水平相近(P=1.00)。
2.4 高原环境下挫伤与非挫伤视网膜各个相同时间点NGF表达的比较 NGF在两组视网膜各相同时间点的表达均存在差异(P<0.05) 。表1 视网膜表达NGF后的平均灰度值比较 (x±s，n=8)注：与亚高原非挫伤组比较，aP<0.01
3 讨论
高原环境由于其特殊的地理和气候因素，可以引起人体多种疾病，高原视网膜病是其中之一，“低氧”则是引起损伤的关键性因素[4]。而眼球钝挫伤作为临床上的一种常见病，视网膜损伤是其引起视功能损害的主要原因之一，也严重影响着高原地区人类的健康。探讨高原环境引起的视网膜损伤及高原环境下眼球钝挫伤后视网膜损伤和修复的特征及其机制，对于高原环境及高原环境下眼挫伤后视网膜损伤的预防和治疗，都有极其重要的意义。视网膜作为中枢神经的一部分，其微弱的再生能力现认为主要与内、外两方面的因素有关：(1)自身缺乏足够的再生能力;(2)所生存的环境中各种外源性生长促进性和抑制性因子的影响[5]。视网膜自身具备的微弱再生能力是难以改变的，但其生存的微环境却可以改变，现已有研究表明，在眼球钝挫伤后损伤视网膜修复的过程中，视网膜生存的微环境中有较多的因素参与影响了此过程[6，7]，神经生长因子NGF也参与其中。NGF是最早发现的神经细胞生长因子，于1948年最先从肉瘤中得到分离和纯化，20世纪70年代确定了它的氨基酸组成及顺序，成为目前唯一被阐明结构的神经细胞生长因子。NGF能促进交感神经和躯体胆碱能神经的生长，也能促进感觉神经的发育和生长，兼有神经元营养和促突起生长的双重效应，对神经元的生长、发育、分化及再生和功能性表达均具有重要的调控作用。NGF与受体结合后，可促进发育神经细胞的生长，维持成熟神经细胞的存活和促使损伤神经细胞的修复和再生[1，8]。许多研究已证实，NGF与眼的发育及视神经再生有关，不仅具有维持视网膜神经节细胞存活的功能，而且可促进视网膜神经节细胞轴突的再生和神经纤维的生长[9]。近年来NGF已被较多地应用于治疗中枢神经系统损伤，且被认为确有疗效[10，11]。
高原地区的眼球钝挫伤使视网膜遭受缺氧和钝挫伤双重损伤因素的影响，NGF在高原低氧环境下视网膜的表达规律如何，眼球钝挫伤后其表达发生了什么样的变化?明确以上问题，可以为合理适时的应用NGF有关的药物治疗高原低氧、高原眼球钝挫伤所引起的视网膜损伤提供理论依据。
从该实验结果可以看出，两种条件下视网膜NGF的表达规律是不同的。单纯高原环境下1天，NGF即在视网膜表达，3天时表达明显增强，7天时达高峰，但较3天无明显增强，而在14天表达明显回落，与1天时表达水平相近，其表达最强是在7天时;高原环境下眼球钝挫伤后1天，视网膜有较微弱的NGF表达，3天表达最强，7天时即有明显回落，14天时较7天又有明显回落，与1天时水平相近，其表达最强是在3天时。比较高原环境下NGF在挫伤与非挫伤视网膜各个相同时间点的表达水平后我们看到，3天时，NGF在挫伤组视网膜的表达较非挫伤组高，而在其余各时间点的表达是挫伤组较非挫伤组低。将两组结果与亚高原非挫伤组相比我们还发现，高原环境下不论是在挫伤组还是在非挫伤组，1天与14天时的表达尚不及对照组，挫伤组尤甚。我们考虑这可能与缺氧有关，高原的低氧抑制了NGF的表达，使得1天 与14天时，两组视网膜NGF的表达低于亚高原非挫伤组。就总趋势看，高原环境下NGF不论是在挫伤组还是非挫伤组，其表达与亚高原环境下相比均有所变化，有各自不同的表达规律，且总体水平是挫伤组低于非挫伤组，这说明NGF不但参与了视网膜在高原急性低氧环境下的病理过程，而且参与了该环境下钝挫伤的病理过程。高原低氧作为一种损伤因素，引起NGF在视网膜的表达发生了变化，而在钝挫伤后的视网膜NGF的表达水平变化趋势更大，说明钝挫伤使得NGF的表达在低氧的基础上又有进一步的变化，呈现新的表达规律。
该实验结果提示我们，高原低氧环境和该环境下的钝挫伤对视网膜NGF的表达水平均产生了影响，且有各自的规律，在钝挫伤后的视网膜的影响更为明显，这说明NGF不但参与了视网膜在高原急性低氧环境下的病理过程，而且参与了该环境下钝挫伤的病理过程。若在损伤修复的过程中都适时合理的应用NGF，可能将比较有效地达到促进损伤视网膜再生的目的，为治疗高原低氧及高原环境下眼球钝挫伤所引起的视网膜损伤提供一个有效的途径。
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