LYVE1在发育中大鼠肾内的表达分析

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【摘要】 目的 探讨淋巴管内皮细胞透明质酸受体1染色阳性（LYVE1+）淋巴管在大鼠肾内的分布。方法 胚胎期第14、16、18、20天的胎鼠，和出生后第1、4、14、21天及成年大鼠的肾脏切成厚50 μm的薄片，进行LYVE1免疫组织化学染色。结果 LYVE1+的淋巴管丛最早可在胚胎期第16天的大鼠肾脏检测到。在胚胎期第18天，出生后第1、4、7天和成年大鼠肾脏可见到LYVE1+丛主要位于肾脏皮质的动脉周围。LYVE1+细胞在胚胎期第14天可检测到，主要位于髓质，出生后阳性细胞数量显著增加，到出生后第21天仅在外髓外带见到少量的LYVE1+细胞。结论 LYVE1+淋巴管主要位于肾脏的动脉周围，LYVE1+细胞主要位于肾脏髓质。
【关键词】 淋巴管内皮细胞透明质酸受体 肾脏 淋巴管
　　【Abstract】 Objective To investigate the distribution of intrarenal lymphatic vessels in developing rat using the lymphatic marker LYVE1.Methods The rat kidneys from embryonic day 14 (E14) to E20， from neonates at pup day 1 (P1) to P21 and adults were investigated.Results LYVE1+ lymphatic vessels were detected and formed lymphatic plexus in rat kidney at the E16 stage. From fetal stage E18 to Adult， LYVE1+ lymphatic vessels were distributed along arteries in cortex. LYVE1+ cells appeared mainly in the medulla at E14. The numbers of the cells increased gradually， then reduced. At P21 LYVE1+ cells were only in OSOM.Conclusion LYVE1+ lymphatic vessels were distributed along arteries and LYVE1+ cells were located in medulla.
　　【Key words】 LYVE1， kidney， lymphatic vessels
　　在人类和各种动物包括小鼠其肾内淋巴管的分布已有研究［1～3］，但是，对发育中肾脏内的淋巴管的来源和分布目前知之不多。本实验应用淋巴管内皮细胞特异标记物——淋巴管内皮细胞透明质酸受体1(lymphatic endothelium specific hyaluronan receptor1，LYVE1)研究大鼠肾脏内淋巴管的表达。恶性肿瘤主要通过血道和淋巴道形成远处转移，统计表明，50%以上的肿瘤经过淋巴道转移，且发生较早，因此，本研究也为肿瘤淋巴道转移机制及抗肿瘤研究提供实验基础。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料与来源 应用Sprague Dawley大鼠，试验动物的饲养及试验操作符合韩国加图立大学动物保护协会的要求。孕鼠由韩国加图立大学医学院动物中心提供。出生前大鼠肾脏来自于胚胎期第14、16、18、20天的胎鼠，出生后肾脏由生后第1、4、14、21天及成年的大鼠获得。每个年龄段应用3～4只。
　　1.2 主要试剂 兔抗小鼠多克隆抗体LYVE1购自Research Diagnostics Inc（稀释度1∶1000）；过氧化物酶连接的驴抗兔IgG购自Jackson ImmunoResearch Laboratories（稀释度1∶100），明胶、皂苷和牛血清白蛋白均购自SigmaAldrich（美国）。
　　1.3 实验方法 试验动物用16.5%的乌拉坦（1 ml/kg）腹腔内注射麻醉。妊娠14～16 d的大鼠仰卧位固定于手术台上，剖腹取胎鼠，分离胎鼠肾脏，PLP固定4°C过夜。利用振动切片机（Pelco 102， Series 1000; Technical Products International， 美国）将肾脏切成厚50 μm组织片，放入-70°C冰箱保存。
　　出生后14～21 d及成年大鼠，PLP腹主动脉灌注固定。分离肾脏，利用超薄切片机（Leica公司，德国）切成1～2 mm 厚，PLP固定4°C过夜。
　　从-70°C冰箱中取出组织，新配制的50 mM NH4Cl/PBS 洗10 min×3次； 0.3% h3O2 10 min；缓冲液B（0.01 M PBS 100 ml，明胶0.2 g，皂苷0.05 g，牛血清白蛋白1.0 g）洗4 h。以上操作均在4°C环境中进行。 在缓冲液B稀释的LYVE1中孵育，4°C过夜。第2天从冰箱取出组织，先室温放置1 h，然后缓冲液C（0.01 M PBS 100 ml，明胶0.2 g，皂苷0.05 g，牛血清白蛋白0.1 g）洗1 h。在过氧化物酶结合的驴抗兔IgG中孵育2 h，缓冲液C洗30 min。每孔滴加0.1%DAB 300 μl，滴加3%过氧化氢溶液45 μl，显色10 min。梯度酒精脱水，丙酮15 min×2次，丙酮：环氧树脂=3∶1 混合液内1 h，丙酮∶环氧树脂=1∶1混合液内1 h；丙酮∶环氧树脂=1∶3混合液内1 h，纯环氧树脂中过夜。封片，烤干。镜下观察，拍照。
　　2 结果
　　2.1 LYVE1在大鼠肾脏中的表达 LYVE1+的淋巴管丛最早可在胚胎期第16天检测到（图1C）。在胚胎期第18天（图2A），出生后第1（图2B），4（图2C），7天（图2D）可见LYVE1+淋巴管丛主要位于肾脏皮质的弓形动脉和小叶间动脉周围。图1A显示成年大鼠肾脏，在皮质LYVE1主要在弓形动脉和小叶间动脉周围的淋巴管和肾小球内表达，在髓质也检测到LYVE1的表达。
　　2.2 LYVE1+单个细胞 LYVE1+单个细胞最早出现在胚胎期第14天的大鼠肾脏髓质中。胚胎期，LYVE1+细胞主要位于髓质，皮质也可见到少量阳性细胞(图1C、D)。出生后阳性细胞数量显著增加，出生后第4天到达顶峰（图1E）。以后，这些LYVE1+细胞的数量从肾乳头开始逐渐减少(图1G)，到出生后21天仅在外髓外带见到少量的LYVE1+细胞（图1I）。
　　在成年大鼠，肾脏的间质中未见LYVE1+单个细胞出现(图1A’)。从图1 B、C’、D、E、G和I可以看出，LYVE1+细胞形状不规则，有多个粗而不规则的突起。
　　A：在成年大鼠，皮质LYVE1主要在淋巴管和肾小球表达（A），在髓质的一些血管束（A’）也有表达。B：在胚胎期第14天，仅有一些弱LYVE1+单个细胞，没有LYVE1+淋巴管。插入图分别显示肾内和肾外的LYVE1+单个细胞。C：在胚胎期第16天，LYVE1+单个细胞的数量急剧增加。C’ 显示LYVE1+单个细胞有粗而不规则的突起。DI：直到出生后第4天，在髓质LYVE1+单个细胞的数量逐渐增多，在肾乳头（F，H）数量逐渐减少。出生后第14天和第21天在外髓外带（OSOM）与外髓内带（ISOM）的交界处仍然有一些弱的LYVE1+单个细胞。E，G，I的插入图显示同一阶段的LYVE1+单个细胞。K：肾脏，SC：脊髓，IM：内髓，Co：皮质。
　　3 讨论
　　淋巴流入血液循环系统具有很重要的生理意义，可以回收蛋白质，运输脂肪和其他营养物质，调节血浆和组织间液的液体平衡，淋巴流动还可以清除因受伤出血而进入组织的红细胞和侵入机体的细菌，对机体起着防御作用。
　　淋巴管系统很少发生威胁生命的疾病，除了少见的先天性淋巴水肿［4］和淋巴管瘤，大多数病理不清楚的良性肿瘤在儿童时期可导致毁容［5］。而且淋巴管也是肿瘤如乳腺癌、肾癌、结肠癌、直肠癌等发生转移的途径之一［6，7］。在一些疾病包括炎症、自身免疫性疾病和癌症，控制淋巴管的转运可能是治疗的一个机会。因此。首先必须了解淋巴管的一些生物学特征。由于缺乏淋巴管特异标记物和很难分离纯的淋巴管内皮细胞［8］，关于淋巴管的发生和发育研究发展非常缓慢。首次真正的进展，来自于Alitalo及其同事［8］发现VEGFC是淋巴管发生的一个特异的生长因子和酪氨酸激酶受体VEGFR3在淋巴管内皮细胞的研究［9］。最近，在淋巴管内皮细胞也发现别的一些受体，包括podoplanin，最先在肾小球足细胞发现的膜蛋白［10，11］以及D6——一种混杂的趋化因子受体［12］和巨噬细胞甘露糖受体［13］。这些标记物的发现，为研究淋巴管的发生和发育提供了可靠的检测目标，促进了研究的进展。
　　LYVE1是目前最常用的淋巴管内皮细胞的标记物［14］。LYVE1是CD44糖蛋白的同源化合物，分布于淋巴管内皮，是一个跨膜糖蛋白，含有322个氨基酸残基，是淋巴管内皮细胞透明质酸（HA）的受体［15］。LYVE1作为透明质酸转运体，可从周围组织跨膜传递透明质酸至淋巴管腔。通过LYVE1的作用，淋巴管内皮细胞摄入透明质酸，并在淋巴管、肝和脾窦内皮细胞进行透明质酸自身的分解代谢［14］。在生理状态下，仅有少量透明质酸进行循环，而在组织损伤或其它病理状态下，透明质酸循环增加。同时，透明质酸的代谢产物还可诱导炎症反应，导致血管的发生，并能够增加趋化因子的产生和聚集树突细胞。在发育过程中LYVE1几乎与Prox1同时表达，这种表达被限制在淋巴管和淋巴结的窦内皮上［16］。LYVE1的这些特性使它为研究胚胎期和病理淋巴管发生提供了有力的工具［17］。
　　我们应用LYVE1作为淋巴管内皮细胞的标记物，发现LYVE1+的淋巴管丛最早可在胚胎期第16天的大鼠肾脏检测到。在胚胎期第18天，出生后第1、4、7天可见到LYVE1+的淋巴管丛主要位于肾脏皮质的弓形动脉和小叶间动脉周围，提示淋巴管是与这些动、静脉几乎同时发生的。成年大鼠肾脏，在皮质LYVE1主要在弓形动脉和小叶间动脉周围的淋巴管和肾小球内表达，在髓质也检测到LYVE1的表达。

令人感兴趣的是，大鼠肾脏也检测到LYVE1+单个细胞。这种细胞最早出现在胚胎期第14天的大鼠肾脏髓质中。胚胎期，LYVE1+细胞主要位于髓质，皮质也可见到阳性细胞。出生后阳性细胞数量显著增加，出生后第4天到达顶峰。此后，这些LYVE1+细胞的数量从肾乳头开始逐渐减少，到出生后21天仅在外髓外带见到少量的LYVE1+细胞。在成年大鼠，肾脏的间质中未见LYVE1+单个细胞出现。而且，LYVE1+单个细胞有粗而不规则的突起。然而，这些LYVE1+细胞存在的作用，目前还不清楚。
　　有报道表明，LYVE1在一些巨噬细胞上也有表达［18，19］，这些LYVE1+巨噬细胞在淋巴管的发生过程中可能起重要作用［20～22］。我们发现的LYVE1+单个细胞是否为巨噬细胞还是别的细胞，还有待于进一步的研究。目前，这一方面的工作正在进行。

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