作者：程虹 张晓晖 刘柏麟 沈万安 马福成
【关键词】 雌激素；，SR
关键词】 雌激素；SRB（B族清道夫受体）；可变剪接
0 引言
小鼠和人类血浆中高密度脂蛋白（HDL）胆固醇的水平与动脉粥样硬化性心血管病的发病率呈显著负相关［1］. 清道夫受体B族II型（SRBII）是SRBI的异构体，具有与SRBI不同的细胞定位与功能［2］，SRBI和SRBⅡ的表达都可被雌激素调节［3］. 我们检测不同类型雌激素对大鼠肝脏SRBI 和SRBⅡ表达水平的影响，并构建SRB微基因，旨在分析雌激素对可变剪接作用调节的分子机制.
1 材料和方法
1.1材料
25日龄去卵巢SD大鼠麻醉后，无菌硅胶囊分别注入17β雌二醇（E2）或17α乙炔雌二醇（EE）后植入背部皮下，对照组植入空的无菌硅胶囊. 于0，3，7，10，14 d分别取肝脏组织，并抽取静脉血，用于免疫印迹分析和雌激素水平测定. SRBI和SRBII抗体购自Novus Biologicals.
1.2方法
冻存肝组织在缓冲液中匀浆后，超速离心提取细胞膜进行SRBI/Ⅱ免疫印迹分析. SRB微基因的构建采用PCR扩增大鼠基因组DNA的SRB基因片段，PCR产物克隆至TA克隆载体并按顺序连接外显子11到外显子13片断. 其中内含子11和内含子12为部分缺失片断. 最后将SRB微基因插入pSG5载体的EcoR I和Not I之间，用于细胞转染和可变剪接的分析. 采用Titan One Tube RT PCR 试剂盒进行SRB微基因mRNA表达的RTPCR分析，引物为pSG5载体序列5′TAATACGACTCACTATAGGGC3′和5′GCTGCAAATAAAC AAGTTCTGC3′.
植入胶囊后大鼠血清中E2和EE的水平均提高，其中前者明显高于后者（10～20倍）. 免疫印迹分析表明，EE和E2使内源性SRBI蛋白表达水平不同程度下调，EE引起的蛋白水平变化与E2相比更显著. 同时，SRBI和SRBII均可检测到糖基化和非糖基化两种表型. 雌激素可以引起糖基化和非糖基化SRBI的表达下调和非糖基化SRBII表达的上调，但未见糖基化SRBII表达的变化. 构建的SRB微基因包含外显子11~13，长1.5 kb，包括了连接位点和含有许多潜在剪接因子的必需区段. SRB微基因pSG5表达载体瞬时转染HepG2细胞后，RTPCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，SRBI和SRBⅡ的剪接产物分别为486 bp和357 bp.
3 讨论
我们的研究表明，雌激素调节SRBI和SRBII蛋白的表达水平，可能是雌激素调控血浆胆固醇水平的机制之一. 另外，非糖基化SRBⅡ在EE用药时表达增加而糖基化SRBII没有变化，表明雌激素可能在翻译后水平调节SRB蛋白的表达. 在小鼠、大鼠和人类中，外显子12(129 bp)跳跃可产生编码SRBI C末端异构体SRBⅡ的mRNA［4］. 我们的结果显示，细胞转染后检测到了两种类型的异构体（SRBI 和SRBⅡ），表明成功构建了一种功能性SRB微基因，为进一步鉴定特异性的剪接因子并研究雌激素调节的可能机制提供了依据.
参考文献
［1］Fluiter K， van Berkel TJ. Scavenger receptor B1 (SRB1) substrates inhibit the selective uptake of highdensitylipoprotein cholesteryl esters by rat parenchymal liver cells［J］. Biochem J， 1997， 326(Pt 2): 515-519.
［2］Webb NR， Connell PM， Graf GA， et al. SRBII， an isoform of the scavenger receptor BI containing an alternate cytoplasmic tail， mediates lipid transfer between high density lipoprotein and cells ［J］. J Biol Chem， 1998， 273(24): 15241-15248.
［3］Graf GA， Roswell KL， Smart EJ. 17betaEstradiol promotes the upregulation of SRBII in HepG2 cells and in rat livers［J］. J Lipid Res， 2001， 42(9):1444-1449.
［4］Rhainds D， Brissette L. The role of scavenger receptor class B type I (SRBI) in lipid trafficking. defining the rules for lipid traders［J］. Int J Biochem Cell Biol， 2004， 36(1): 39-77.转贴于