关于PBK/TOPK在人乳腺及乳腺癌组织的表达及意义

【摘要】 目的： 观察PBK/TOPK在人正常乳腺及乳腺癌组织的分布和表达，探讨作为肿瘤标志物的可能性. 方法： 应用免疫组织化学EnVision法，在含有人体20种正常组织及14种癌组织的组织芯片上进行PBK/TOPK 染色，检测PBK/TOPK 蛋白的表达. 结果： 在20种正常组织中，只有头皮的汗腺、睾丸的精原细胞、肝脏的胆管上皮、食管粘膜下腺体、胰腺外分泌部的导管上皮和肾脏的远曲小管7种组织有不同数量细胞明确阳性表达. 在14种癌组织中，只有乳腺癌、肺癌、甲状腺癌3种癌组织中存在PBK/TOPK 的大量强阳性表达，而在正常乳腺组织不表达PBK/TOPK. 结论： PBK/TOPK在正常组织的阴性表达及其相应恶性肿瘤的强阳性表达，为其成为研究肿瘤起源与发生的标志物提供了一定依据.
【关键词】 组织芯片；组织；癌；PBK/TOPK；免疫组织化学
　　【Abstract】 AIM: To study the expression and significance of PBK/TOPK in normal breast tissue and breast carcinoma tissue so as to explore the possibility of PBK/TOPK as a maker of breast carcinoma. METHODS: The expression of PBK/TOPK was detected in normal tissue chips including 20 types of human normal tissues and in tumor tissue chips including 14 types of carcinomas by using EnVision immunohistochemical staining. RESULTS: PBK/TOPK was expressed in some certain normal tissues and special cells， such as the sweat glands of scalp， distal renal tubular epithelial cells，esophageal submucous glands， pancreatic ductal epithelial cells and biliary epithelial cells. PBK/TOPK protein was strongly expressed mainly in breast carcinoma， thyroid carcinoma and lung carcinoma， but negative in normal breast tissues. CONCLUSION: PBK/TOPK is negative in several normal tissues， but strongly positive in relative carcinoma， which suggests that it could be a useful tumor marker in clinical oncology.
　　【Keywords】 tissue chip; tissues; carcinoma; PBK /TOPK; immunohistochemistry
　　0引言
　　最近研究表明，PBK/TOPK（PDZbinding kinase/TLAK celloriginated protein kinase）在乳腺癌细胞高表达［1］，为探讨其能否成为诊断乳腺癌标志物提供了思路. 有人用Northern Blot方法研究了PBK/TOPK在人体多种正常组织的分布，但未能明确其分布的细胞类型. 此外，对其在人体常见恶性肿瘤表达分布的研究也未见报道. 组织芯片(tissue chip)具有高通量、省时、省力、节约经费和试验结果可比性强等优点. 我们用免疫组化EnVision方法和组织芯片技术，观察了PBK/TOPK在人体包括乳腺在内的20种正常组织和包括乳腺癌在内的14种癌组织的表达和分布，试图探讨PBK/TOPK成为乳腺癌或其他上皮性恶性肿瘤标志物的可能性.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　人体正常组织和癌组织芯片购自超英公司. 所有石蜡标本均来自第四军医大学西京医院病理科. 包括正常人体组织20种即脑、食道、胃、结肠、直肠、小肠、肝脏、胰腺、骨髓、卵巢、乳腺、宫颈、睾丸、前列腺、肺、脾脏、肾脏、淋巴结、胸腺及表皮各5例. 癌组织14种，包括食道癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肾癌、皮肤鳞状细胞癌、甲状腺癌各3例，另宫颈癌6例. 一抗： 非磷酸化的PBK/TOPK（鼠单克隆或兔多克隆）抗体购自Cell Signaling公司，EnVision试剂盒购自福州maixin公司.
　　1.2方法
　　EnVision二步法. 用石蜡组织块4 μm连续切片，常规脱蜡至水，TBST冲洗3次， 3 mL/L h3O2灭活内源性过氧化物酶15 min，微波修复后，5 g/L BSA封闭10 min，加入1∶70稀释的PBK/TOPK一抗，4℃过夜；37℃复温1 h，TBST漂洗，加入EnVision二抗孵育1 h，DAB显色，苏木素复染，脱水封片. 阴性对照：用正常小鼠血清或PBS替代一抗. 结果判定：阳性着色为棕黄色颗粒，表达于胞膜和胞质；阴性:未见明确阳性细胞.
　　2结果
　　在1例结肠粘膜的腺管上皮中有少数强阳性表达的细胞；1例食管黏膜下腺体有阳性表达细胞；胆管上皮有明确阳性表达；1例基底细胞有弱阳性表达；胰腺外分泌部导管上皮有少数散在阳性细胞；精母细胞阳性表达；生精活跃者，阳性表达细胞多；1例远曲小管上皮细胞有明显表达；表皮基底细胞有较强着色. 在癌组织中，2/3例阳性表达者，有乳腺癌、肺癌及甲状腺癌. 鉴于PBK/TOPK在5例正常乳腺组织中全部阴性表达，而在乳腺癌中高表达，我们又收集了 外科手术切除的5 例乳腺癌及其周围乳腺组织进行研究. 结果发现，全部病例PBK/TOPK强表达（图1A），肌上皮均为阴性. 而5例乳腺癌组织也表达PBK/TOPK（图1B）. 肺癌及甲状腺癌组织因正常组织芯片中未能包括相对应的对照信息，故未作进一步比较研究.

转贴于 　　3讨论
　　PBK/TOPK是一种新发现的丝苏氨酸激酶，属于MAPKK分子家族，在人体正常组织中有不同程度的表达. 用Northern方法发现，在成人正常睾丸、胎盘、心肌和胰腺组织中检测到了PBK/TOPK的表达，其中胎盘含量最丰富，在骨骼肌、肾脏、肝脏和肺脏中有低水平表达 ［2］. 但是，在胎儿的肾脏、肺脏中可检测到PBK/TOPK的mRNA. 同时，在胎儿的脑组织、脾脏和睾丸中检测到了PBK/TOPK的表达［3］. 增殖的神经多能祖细胞表达PBK/TOPK，而静止期的神经干细胞和NeuN阳性的成熟神经细胞中不表达［4］. 但是，在人正常乳腺组织是否表达PBK/TOPK及其定位于那种细胞，至今尚未见文献报道. 究竟PBK/TOPK定位在人体正常组织的哪些细胞并不清楚.
　　
　　为了进一步明确PBK/TOPK表达与细胞定位，我们用EnVision法对人体包括乳腺在内的20种正常组织和包括乳腺癌在内的14种癌组织芯片进行了研究，结果发现，许多正常组织不表达PBK/TOPK，而多种癌组织如乳腺癌、甲状腺癌和肺癌等存在PBK/TOPK过表达（图B），这提示PBK/TOPK可能作为鉴别上述癌和非癌一种标志物. 为进一步证明上述推论，我们选择了组织芯片可见PBK/TOPK过表达的常见恶性肿瘤乳腺癌进行研究，观察了5例乳腺癌及其癌周组织手术标本，结果发现部分癌周组织的腺上皮也有强阳性表达，而肌上皮为阴性，这说明PBK/TOPK并不能作为鉴别乳腺癌的标志物，但对区分乳腺上皮细胞与肌上皮细胞具有实用意义. 我们的结果还表明，PBK/TOPK在上述组织细胞的表达，并不一定反映细胞的增殖状态，表明PBK/TOPK可能还有其他重要的生物功能.
　　我们用含有人多种正常和癌组织的组织芯片，并用手术标本进一步验证，结果表明，除PBK/TOPK与细胞增殖周期有关外［3］，首次报道了PBK/TOPK在人体组织如乳腺等的定位细胞，这对PBK/TOPK生物学功能及其作为鉴别标志物的深入研究均具有重要的理论与实用意义.
基金项目：学校训练部学员课外科研课题资助(2006)

参考文献

　　［1］Park JH， Lin ML， Nishidate T， et al. PDZbinding kinase/TLAK celloriginated protein kinase， a putative cancer/testis antigen with an oncogenic activity in breast cancer［J］. Cancer Res， 2006， 66(18):9186-9195.

　　［2］Abe Y， Matsumoto S， Kito K， et al. Cloning and expression of a novel MAPKKlike protein kinase， lymphokineactivated killer Tcelloriginated protein kinase， specifically expressed in the testis and activated lymphoid cells［J］. J Biol Chem， 2000， 275， 21525-21531.

　　［3］SimonsEvelyn M， BaileyDell K， Toretsky JA， et al. PBK/TOPK Is a Novel Mitotic Kinase Which is Upregulated in Burkitt’s Lymphoma and Other Highly Proliferative Malignant Cells［J］. Blood Cell Mol Dis， 2001，27，825-829.

　　［4］Dougherty JD， Garcia AD， Nakano I， et al. PBK/TOPK， a proliferating neural progenitorspecific mitogenactivated protein kinase kinase［J］. J Neurosci， 2005，25，10773-10785.