摘要：近年来，国内外对石油及兵产品的微生物降解研究常见报道，却鲜见机油废水微生物降解方面的研究。本试验目的是通过常规微生物驯化方法，以市售机油为唯一碳源，从油污土壤中分离筛选出机油高效降解菌株，并对其生长条件及降解特性进行研究，以期进一步应用于含油污水的治理。
关键词：微生物 机油污染废水 微生物降解
tract: Two strains of high-effective， lubricating oil degrading bacteria， ZL1 and ZL2， were screened out from oil-contaminated soil， which were preliminarily identified as flavobacteriun and tnicrococcus. The effects of temperature， oil content and pH value on their oil-degrading capacities were dletermined by orthogonal experiment of growth conditions. A degrading capacity experiment was carried out with an initial wastewater oil content of 270 mg/L. The experimental results showed that the oil removal rates by the strains ZL1 and ZL2 from the in-oculum in about 2 days were up to 67. 9% and 76. 2% respectively and the adaptation range of strain ZL2 to oil content and pH value was wider than that of ZL1.
Key Words: lubricating oil; oil-containing wastewater; wastewater treatment; microorganism; flavobacteri-un; micrococcus
近年来，国内外对石油及兵产品的微生物降解研究常见报道，却鲜见机油微生物降解方面的研究。本试验目的是通过常规微生物驯化方法，以市售机油为唯一碳源，从油污土壤中分离筛选出机油高效降解菌株，并对其生长条件及降解特性进行研究，以期进一步应用于含油的治理。
1 材料与方法
1．1 土壤样品
某石油库贮油罐附近的石油污染土壤，取样3份，按含油量由多至少编为1＃，2＃，3＃。
1．2 培养基
本试验选取两种无机基础培养基，（用蒸馏水配制并高压蒸气灭菌），编号分别为1＃，2＃，组成如下：
1＃基础培养基：p（KH2PO4）＝0.5g／L，ρ（K2HPO4）＝0.5g／L，P（MgSO4·7H2O）=0.2g／L，ρ（NaCl）=0.2g／L，p（CaCl2）＝0.1g／L，ρ（NH4NO3）＝1.0g／L，MnSO4痕量，FeCl3痕量。
2＃基础培养基：p（NaNO3）=2.0g／L，ρ（KH2O4）＝0．2g／L，ρ（MgSO4.7H2O）＝0.2g／L，ρ（酵母浸膏）＝1.0g／L．
含油培养基是向上述无机基础培养基中加入适量机油。固体培养基中加入质量分数为0．2％的琼脂。
1．3 优势菌筛分试验
1．3．1 选择富集培养
称取土样各10g，加入到500mL1＃含油培养基（含机油4mL）中，调pH值7.0，通气恒温30℃培养48h后，分别移取上述培养液5mL于45mL1＃，2＃含油培养基（含机油2mL）中，恒温30℃振荡培养。
1.3.2 平板分离
制作1＃，2＃固体含油培养基平板苦干，用接种环蘸取振荡培养较好的菌液在相应平板划线，恒温30℃培养48h后平板划线分离，重复数次。选择生长状况良好的菌株进行平板扩大培养。
1．4 生长条件正交试验
在保证供氧和氮、磷营养前提下，选择温度。油的质量浓度（以mg／L计）和pH值作为本次实验的三个因素进行三水平实验，方案见表1、表2。将平板培养48h的菌体刮下，5000r／min离心5min，分离得到湿菌体。向方案中每个样品加入0.5g湿菌体，培养60h后测定样品中油的质量浓度。
| 分组号 | 因素 | 测定结果ρ（油）/（mg.L-1) | 降解测量ρ（油）/（mg.L-1) | ||
| 温度/ | ρ（油）/（mg.L-1) | pH值 | |||
| 1 | 25 | 424 | 5.0 | 192 | 232 |
| 2 | 25 | 680 | 7.0 | 416 | 264 |
| 3 | 25 | 824 | 9.0 | 630 | 194 |
| 4 | 30 | 424 | 7.0 | 220 | 204 |
| 5 | 30 | 680 | 9.0 | 507 | 173 |
| 6 | 30 | 824 | 5.0 | 654 | 170 |
| 7 | 35 | 424 | 9.0 | 297 | 127 |
| 8 | 35 | 680 | 5.0 | 569 | 111 |
| 9 | 35 | 824 | 7.0 | 755 | 69 |
| K1 | 690 | 563 | 513 | ||
| K2 | 547 | 548 | 537 | ||
| K3 | 307 | 433 | 494 | ||
| K1 | 230 | 188 | 171 | ||
| K2 | 182 | 183 | 179 | ||
| K3 | 102 | 144 | 165 | ||
| R | 128 | 44 | 14 | ||
| 分组号 | 因素 | 测定结果ρ（油）/（mg.L-1) | 降解测量ρ（油）/（mg.L-1) | ||
| 温度/ | ρ（油）/（mg.L-1) | pH值 | |||
| 1 | 25 | 368 | 4.0 | 69 | 299 |
| 2 | 25 | 574 | 6.0 | 267 | 307 |
| 3 | 25 | 767 | 8.0 | 479 | 288 |
| 4 | 30 | 368 | 6.0 | 354 | 314 |
| 5 | 30 | 574 | 8.0 | 296 | 278 |
| 6 | 30 | 767 | 4.0 | 462 | 305 |
| 7 | 35 | 368 | 8.0 | 142 | 226 |
| 8 | 35 | 574 | 4.0 | 342 | 232 |
| 9 | 35 | 767 | 6.0 | 548 | 219 |
| K1 | 824 | 769 | 766 | ||
| K2 | 897 | 817 | 840 | ||
| K3 | 677 | 812 | 792 | ||
| K1 | 275 | 256 | 255 | ||
| K2 | 299 | 272 | 280 | ||
| K3 | 226 | 271 | 264 | ||
| R | 73 | 16 | 25 | ||
1.5 降解能力试验
配制机油质量浓度为270mg／L的含油培养基1L，投入小型间歇反应器中，加入离心分离得到的湿菌体5g，通气恒温30℃培养，间隔12h取样测定其含油量。
1．6 测试方法
用紫外介光光度法测定。
2 结果分析
2．1 优势菌筛分试验
富集培养过程中，1＃土样的培养液出现的泡沫较多，乳化现象明显，菌液也较为粘稠，分离出较多的菌株，说明土壤中的石油烃能刺激石油降解菌的生长。经过选择富集培养、平板分离出4株以机油为唯一碳源的菌株，编号为ZL1，ZL2，ZL3，ZL4，性状见表3。进一步培养后筛选出降解性能较好的ZL1（1＃培养基）和ZL2（2＃培养基）进行正交试验和连续培养试验。
| 形态特征 | ZL1 | ZL2 | ZL3 | ZL4 |
| 菌落颜色 | 粉红 | 淡黄 | 淡黄 | 粉红 |
| 菌落形态 | 不透明，微隆起，全缘， | 半透明，圆形 | 半透明，圆形，隆起， | 不透明，米粒状突起， |
| 光滑，有光泽 | 光滑，较干燥 | 光滑，有光泽 | 较湿润 | |
| 菌体形态 | 短杆 | 球形 | 杆状 | 丝状 |
| 菌体大小/μm | （0.3-0.8)×(0.6-1.0） | Φ0.3 | （0.5-0.8)×(1.3-5.0) | 0.2×(6-60) |
| 革兰氏染色 | G | G | G | G |
| 初步鉴定 | 黄杆菌属 | 微球菌属 | 假单胞菌属 | 酵母菌属 |
2．2 生长条件正交试验
ZL1，ZL2菌株按设定的正交试验方案进行试验，测定其剩余含油量，以降解油量作为考察指标，计算结果见表2、表3。分析极差值R可以看出：ZL1菌的R温度为128，ZL2菌的R温度为73，均为最大极差值，说明温度是影响降解效果的主要因素。25℃ZL1菌降解机油能力较强；油质量浓度越低降解效果越好；pH值为7时，降解效果最好，说明ZL1菌适于在中性条件下生长。30℃ZL2菌降解机油能力较强；机油的质量浓度在368-767mg／L范围内对降解效果影响不大，以ρ（油）=574mg／L时降解效果最明显，还应进一步扩大试验的油含量范围以确定油含量对ZL2菌降解能力的影响；pH值在4－8范围内对降解效果的影响也不显著，其中PH值为6时降解效果最好，说明ZL2菌较适于在中性偏酸条件下生长。
2.3 降解能力试验
向1L油质量浓度为270mg／L培养液中投加5g湿菌体进行间歇培养，考察ZLI，ZLZ菌的降解能力，结果见图1。由含油量与培养时间关系曲线可以看出：ZL1，ZL2菌被加人含油培养基后很快适应环境，随着培养时间的增长，含油量不断下降。ZL1菌在30h左右去除率达到最大，后含油量下降缓慢，到60h左右曲线趋于平直；ZL2菌在20h左右去除率达最大，48h左右曲线趋于平直。曲线说明ZL1，ZL2菌适应能力较强，ZL1菌在0－60h内生长旺盛对机油的去除率可达67．9％，ZL2菌在0－48h内生长旺盛，对机油的去除率高达76.2％，试验后期降解曲线趋于平直，含油量基本不再变化，可能是由于机油中的一些重组分难于降解的原因。
3 结论
①石油污染土壤较适于做高效石油降解菌驯化菌源。筛选到两株高效机油降解菌ZL1，ZL2。通过正交试验得出ZL1黄杆菌属适于在25℃，油的质量浓度在424mg／L左右，中性条件下生长。ZL2微球菌属适于在 30℃，油的质量浓度在574mg/L左右，中性偏酸条件下生长。
②温度对ZL1，ZL2菌的机油降解能力影响较大。ZL2菌的PH值、机油浓度适应范围较广，有较好的应用前景。
③ZL1，ZL2菌对初始机油质量浓度为270mg／L培养液的去除率分别达到67.9％和76.2％，混合菌株的降解效果有待进一步研究。