环肽的合成方法

多肽药物在治疗上的重要性，越来越引起广大药学工作者的重视。根据肽链的构成可将多肽分为同聚肽（Homomeric）和杂聚肽（Heteromeric）两大类，前者完全由氨基酸组成，后者是由氨基酸部分和非氨基酸部分组成的，如糖肽。根据肽键的结构又分为直链肽和环肽。其中直链肽的研究最为广泛和深入，尤其在直链肽的合成技术方面无论是液相法还是固相法都已成熟。虽然许多直链肽体外具有很好的生物活性和稳定性，但是进入体内后活性很快消失。因为体内环境复杂，存在各种各样的酶。直链肽在酶的作用下很快降解，导致活性丧失[1-2]。另外，直链肽在液相里的构象柔性使得不大容易符合受体的构象要求。这些不利因素造成多肽药物仍有许多问题有待解决。为了得到生物活性优秀半衰期长，受体选择性高的多肽，文献报道过很多多肽改造的方法，其中包括将直链肽改造成环肽[3-8]。这种大环分子具有明确的固定构象[9]，能够与受体很好地契合，加上分子内不存在游离的氨端和羧端使得对氨肽酶和羧肽酶的敏感性大大降低[10-12]。一般地说，环肽的代谢稳定性和生物利用度远远高于直链肽[13]。鉴于环肽的诸多优点，近年来对多肽研究的热点已转移到环肽的合成和生物评价上。
　　根据环肽的环合方式又分为首尾相连环肽（Head-to-tail）、侧链和侧链相连环肽(Sidechain-to-sidechain)[14]、侧链和端基相连环肽（Sidechain-to-end）[15]、含二硫桥的环肽（Disufide-bridge）[16-18]、以及含有其他桥连结构的环肽[19-23]。从合成方法上讲，首尾相连的环肽的合成难度最大。因为环肽的前体-直链肽的肽键具有很强的p键特征，分子更偏爱形成反式构象，呈舒展状态，造成属于反应中心的端基的羧基和氨基在空间上距离较远，不利于发生分子内缩合反应，有利于分子间缩合。
首尾相连的环肽通常是N端和C端游离的直链肽在稀溶液中（10-3~10-4M）由羧基和氨基形成酰氨键来合成。直链前体中的氨基酸种类和数目对成环的难易程度和环肽的收率起着至关重要的作用。甘氨酸、脯氨酸或D-构型氨基酸具有诱导b-转角（b-Turn）的作用，常被认为可增加成环的可能性和收率[24-25]。
　　Scheme 4. Peptide Cyclization via the acyl azide（X=Z or Boc，R=Me，Et，Bzl）
　　Bodansky最早应用迭氮法合成了cyclo(D-Ala-D-Ala-Val-D-Leu-Ile)，虽然上述环肽不具有其母体化合物malformin的生物活性，但合成它为应用迭氮法合成环肽开辟了前景[35]。
　　应用迭氮法合成环肽的另一个成功的例子是内皮素拮抗剂的合成。Endothelin(ET)是一种高效的血管收缩剂，由21个氨基酸残基组成[36]，其受体拮抗剂之一cyclo(D-Trp-D-Asp(OtBu)Fmoc-Ser-D-Val-Leu)的合成过程[37]如下：

　　为了进一步验证HoAt类缩合剂在合成环肽中的优势，Ehrlich选择了使用一般缩合剂难于得到的thymopentin类似物作为研究对象，对HAPyU、PyAOP和HATU就环合的产率及环合过程中发生的二聚和C端酪氨酸残基构型的改变进行了系统的比较。结果表明，在线性多肽浓度为0.1mmol/L，DIEA三倍过量，HAPyU为缩合剂时，单体环肽的收率最高，达到82%，未检测到D-Tyr-异构体和二聚体，说明这一条件是合成thymopentin类似物的最适条件，其他缩合剂在环合时，一则收率偏低，甚至不反应，二则造成酪氨酸消旋化。虽然延长时间可以增加收率，但随之而来的是酪氨酸消旋化的增加[58]。
　　Phakellistatin 5[59]是一种从海绵中提取得到的环七肽，Pettit等采用固相法得到直链前体后，以PyAOP为缩合剂，得到收率为28%的R-Asn-Phakellistatin 5。
　　Mink等人以N端Boc保护的天冬氨酸和丝氨酸苄酯为原料，采用液相法经多步反应得到具有多个噁唑结构的直链前体，N端和C端经氢解和酸脱保护后以HATU为缩合剂，得到了平面结构的Dolastatin E类似物。这种具有多种功能团的化合物可用于超分子化学和组合化学[60-62]。
　　此外，具有辅助放射性同位素（111In和125I）进入血小板的载体功能的Dolastatin D类似物Cyclo[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(or Tyr)][63]，以及对血小板生长因子具有拮抗作用的血小板生长因子B链序列类似物Cyclo(Arg-Lys-Iles-Gla-Ile-Val-Arg-Lys-Lys-Cys)也是采用HATU为缩合剂进行环合反应得到的[64]。
　　从以上给出的例子可以看出，环肽合成的缩合剂不象DCC那样具有普遍的适用性。不同的环肽合成要求不同的缩合剂。

　　Jame P.Tam[88-90]等建立了分子内转移硫内酯化和Ag+离子辅助环合来制备非保护环肽的方法。对于N端为半胱氨酸，C端为硫酯的线性多肽，在pH=7的磷酸缓冲液中，巯基与硫酯基生成共价的硫内酯，这种硫内酯自发地经过S原子到N原子酰基迁移而形成环肽，如图：

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