SSR标记技术在种子纯度鉴定中的研究进展

　　论文关键词：种子纯度　SSR标记　研究进展

　　论文摘要：种子纯度在种子生产中的地位日益提高，以往的形态鉴定等方法难以满足人们的要求。随着分子标记技术的发展，越来越多地被应用到种子纯度鉴定中。本文介绍了SSR分子标记技术的基本原理和特点，简要叙述了SSR标记技术在农作物种子纯度鉴定上的研究进展，并就其在杂交种纯度方面的应用潜力进行了探讨。

　　Key words: Seed purity; SSR markers; Research progresses

　　Abstract：The status of Seed purity are increased in seed production .It is difficult to meet people that the methods of past identifications. With the development of molecular markers， SSR are applied to the identification of seed purity increasingly. In this paper， SSR molecular marker technology， the basic principles and characteristics are summarized.It is described the research progresses of SSR markers in the purity of crop seed. And， it is discussed the potential applications in the purity of hybrid.

　　1.前言

　　随着我国农业经济的发展和种子市场的逐步规范，种子的真假和纯度对种子生产具有越来越重要的影响。为了保护农民以及育种者的利益，发展快速、稳定、可靠的品种纯度鉴定方法具有重要的意义。种子品种纯度鉴定主要包括品种真实性和品种纯度鉴定两个方面。品种鉴定主要指对供检样品的真实性进行鉴定。品种纯度就是对品种的一致性进行分析。种子纯度是种子质量的核心指标，是衡量种子质量的主要标准，种子纯度的高低对农业生产的产量和品质有较大的影响，因此在种子生产、加工、贮藏和经营贸易中有重要的意义，历来受到种子管理部门、种子生产者和用种者的密切关注。

　　品种纯度检验的方法很多，有籽粒形态鉴定，幼苗鉴定，蛋白质电泳鉴定和田间小区种植鉴定等［1］，但这些方法均有不足之处。籽粒形态鉴定可以鉴别性状差异明显的，但这种差异性状较少，准确性差；幼苗鉴定适用于性状表现差异较大的品种，能够鉴定的品种少；蛋白质电泳由于遗传种质资源的狭窄，品种间的差异越来越小，难以鉴定。纯度鉴定最可靠的方法是田间小区种植鉴定，但是这种方法需要一个生长季节，时间较长，耗费较多的人力物力。而且上述方法受人为因素的影响较大，导致检测结果产生误差。为了克服这些缺陷，人们不断地探索新的方法。

　　随着科学技术的进步，分子生物技术逐渐应用于品种纯度的检验，以遗传物质DNA为基础的分子标记技术也逐渐受到人们的亲睐。DNA分子标记技术本质上是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段［2］，由于其快速、准确、可靠、不受环境因素的影响，越来越多地被应用到种子纯度检测中。

　　SSR是近年来发展起来的一种DNA分子遗传标记技术，是建立在PCR（Polymerase Chain Reaction）基础上的，在植物基因组中的应用非常活跃，已被广泛应用于基因定位，种子进化及遗传多样性的研究［3］。目前，SSR技术由于其具有数量丰富，多态性高，呈显性遗传等特点，在种子纯度检测中得到广泛应用。

　　2. SSR标记的原理及特点

　　2.1 SSR标记的原理

　　SSR（Simple Sequence Repeat，简单重复序列）又称微卫星DNA，是一类由几个（多为1～6个）核苷酸为单位串联重复而成的DNA序列，长度一般在100bp以内，较短［4］。这些短的串联重复是在DNA复制过程中，由于DNA滑动、复制时，滑动链与互补链碱基错配，而产生的一个或几个重复单位的插入或缺失。Valdas等认为，每一次突变都会增加一个或几个重复单位，从而导致新的等位基因的出现[5]。

　　微卫星DNA是一种非常活跃的碱基序列，广泛分布于各类真核生物基因组的不同位置，而且分布比较均匀，能参与遗传物质的结构改变，基因调控及细胞分化等过程，有自身特异性结合蛋白，还能直接编码蛋白质[6]。微卫星基因序列中，重复基因的重复次数不同，且重复的基因序列不同，产生了简单序列长度多态性和随机扩增微卫星多态性，从而反映高度的等位基因多样性。由于微卫星位点两侧的DNA序列较为保守，根据两侧的这个保守序列设计特定的引物，并通过PCR扩增，将其间的核心卫星DNA序列扩增出来，结合聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，就可以对这些多态性进行比较分析。

　　2.2 SSR标记的特点

　　SSR技术采用PCR进行检测，所需DNA样品量少，仅需微量组织，且质量要求不高，即使DNA部分降解，也能进行有效分析鉴定。SSR呈共显性遗传，可鉴别杂合子和纯合子，且多态性丰富，每个位点均有许多等位形式，重复性好，结果稳定可靠［7］。SSR技术既有RFLP技术的稳定性和共显性的优点，又比RAPD标记成本低，技术简单，是目前较受欢迎的分子标记技术。

　　3.SSR标记技术在种子纯度鉴定中的应用

　　由于SSR标记以孟德尔方式遗传，呈共显性的特点，利用杂交种亲本在某些SSR位点的差异，就可以将亲本与杂交种区分开。到目前为止，SSR技术已在多种农作物种子的品种纯度鉴定中得到应用。

　　3.1 SSR标记技术在玉米种子纯度鉴定中的应用

　　玉米是我国的主要农业作物，利用SSR技术进行玉米种子纯度鉴定，已经筛选出多对可利用的引物，综合运用SSR核心引物和DNA指纹图谱，可以准确地鉴定父本、母本、混杂品种及真实杂交种，其鉴定结果与RFLP结果及系谱来源基本一致。有关的报道：李新海，袁力行等［8］利用SSR标记研究了70份我国主要玉米自交系的遗传变异，用64对扩增带型稳定的引物，从供试材料中测出248个等位基因变异，将70份自交系划分为6个类群，划群结果与系谱分析与育种家经验相符。番兴明，陈洪梅等［9］利用SSR标记将我国温带玉米主要杂种优势群的4个标准测验种和5个热带玉米25个典型自交系划分为4个类群，结果与系谱来源基本一致。Smith等［10］报道了用131对SSR引物对58个玉米自交系的划群结果与RFLP结果基本相同。

　　3.2 SSR标记技术在水稻种子纯度鉴定中的应用

　　对生产上大面积推广的水稻杂交种进行SSR纯度鉴定，并与田间纯度鉴定结果进行比较研究，结果表明，SSR鉴定的平均纯度与田间鉴定结果无显著差异，杂种条带与父母本互补，能区分恢复系和不育系。李稳香，詹良才［11］用SSR指纹图谱标记对10个杂交水稻组合的子一代种子纯度进行鉴定，并人为掺杂与田间种植验证。结果表明，有62对引物能够有效鉴别出1～10个杂交水稻组合及其亲本种子，人为掺杂与田间种植验证与SSR鉴定结果完全一致。谭智丹，余显权等［12］应用SSR技术鉴定了6个杂交水稻组合的种子纯度，结果筛选出10对多态性、特异性较好的引物，都可以区分杂交组合和父母本，其中两个引物所有杂交组合均表现父母本条带的完全互补型。彭锁堂，庄杰云等［13］对我国9个主要的杂交水稻组合及其亲本进行SSR标记分析，21对多态性引物共扩出62条条带，能有效区分所有恢复系和大部分不育系，杂交种条带均为父母本的互补型。

　　SSR技术在种子纯度鉴定中的应用非常广泛，在小麦，大豆，棉花，西瓜，甜瓜等作物及蔬菜作物种子中都有报道。徐如宏，任明见等［14］采用SSR技术对30个小麦品系进行研究， 12对引物共检测到37个等位位点，可将30个小麦品系分为5类。关荣霞，刘燕等［15］利用SSR方法对4个大豆品种进行纯度鉴定，10个植株混合时，即使有一个单株为杂合位点也能被检测出来，并发现用3-5对位于不同连锁群的SSR引物可以对随机或混合样品进行快速、准确的纯度鉴定。刘勤红，王芙蓉等［16］利用SSR标记技术鉴定鲁棉研15号杂交种纯度，筛选了217对SSR引物，获得了十几个足以区分该品种的父母本及其F1的标记位点，可以快速、准确地进行鲁棉研15号杂交种的纯度鉴定。艾呈祥，等在甜瓜，西瓜［17］杂交种纯度检验中利用SSR分子标记技术研究杂种与其双亲之间扩增谱带的多态性，所试验的部分引物在某些自交系中扩增出两条带，杂交种条带均为父母本的互补型，很适合做杂交种纯度鉴定。沈金雄，陆光远等［18］利用SSR、显性形态标记性状花叶及显性生化标记种子芥酸含量鉴定甘蓝型油菜种子纯度，3种方法结果基本一致，一对SSR引物即可用于鉴定F1杂种纯度。SSR扩增产物具有很高的多态性和严格的保守性，不仅可以用于油菜杂种纯度鉴定，也可以用于不同品种（组合）真实性鉴别。刘冠明，郑奕雄等［19］对南方花生主产区的20个品种进行了SSR标记分析，从64对SSR引物中筛选出4对构建了20个花生品种指纹图谱，能将19个品种区分开。另外也有报道用SSR标记进行豇豆、番茄、黄瓜、辣椒等蔬菜的品种鉴定。

　　4.展望

　　随着分子标记技术的不断发展和杂交新品种的不断涌现，利用SSR技术进行品种纯度鉴定已成为一项重要的手段。应用SSR分子标记技术进行种子纯度鉴定，时间短，不受环境条件的影响，利用种子或幼苗就可以进行，可获得大量信息，形态鉴别难以区分的细微差异，也可以准确快速地区分出。

　　SSR分子标记虽具有信息量大，结果稳定可靠，重复性好等优点，但是由于这种方法必须知道重复序列两端的序列信息，依此确定引物序列。前期的筛选重复序列和引物设计费用较高，使SSR技术的实际应用受到限制，一旦特异性好的引物确定，费用则大大降低，操作也简便了。目前发现的SSR序列多为二核苷酸重复，而且比较少，难以满足各类检测和基因做图的要求，这就需要探索发现更多的SSR位点。随着人们不断地研究探索，更多的SSR位点被标记，能够从数据库中查询设计合成的SSR引物和其他作者发表的SSR引物越来越多，开发成本逐渐降低，SSR标记技术在种子纯度鉴定方面具有更广阔的应用前景。

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