UPLCMS测定人血清中霉酚酸浓度的研究

　　　　 作者：胡岚岚，汤建林，周世文，刘智远，刘明，徐颖

【摘要】 　　目的 建立一种快速、准确测定人血清中霉酚酸浓度的超高效液相色谱质谱（UPLCMS）测定方法。方法 在血清中加入内标吲哚美辛，采用超高效液相色谱联合质谱的方法对血清中的霉酚酸进行分离测定。结果 霉酚酸在0.05～100.00 μg/mL的浓度范围内呈良好线性，r=0.9980，最低检测线为0.05 μg/mL，方法回收率大于91.2%，日内、日间变异系数均小于5%。结论 该方法准确、快速、灵敏，可用于霉酚酸的治疗药物监测、人体内药代动力学及生物等效性研究。

【关键词】 霉酚酸；超高效液相色谱质谱；血清

　　Abstract: Objective To establish a rapid and accurate method using UPLCMS for quantification of mycophenolic acid in human serum.Methods Indometacin was added to human serum sample and mycophenolic acid in human serum was determined by UPLCMS . Results The calibration curve was linear (r=0.9980)among the concentration range of 0.05～100.00 μg/mL and the limit of the quantitative detection was 0.05 μg/mL. The recovery of the method was higher than 91.2%. The coefficients of variation for interday and intraday were both lower than 5%.Conclusion As an accurate， rapid and sensitive method， this assay can be used in the supervision of mycophenolic acid drug and the study of pharmacokinetics and bioavailability.
　　
　　Keywords: mycophenolic acid; UPLCMS; serum

　　马替麦考酚酯(mycophenolate mofetil)是霉酚酸(MPA)的2吗啉代乙酯，在体内脱脂化后形成具有免疫抑制活性的代谢物MPA，MPA选择性作用于T、B淋巴细胞，抑制其增殖。临床上用于预防急性器官排异反应，治疗同种异体肾移植后难治性排异反应。霉酚酸的血药浓度测定方法国内外已有报道[17]，但以高效液相色谱分离、荧光检测居多，且多数样品处理过程繁琐，分析时间长。本文在

参考文献

的基础上采用超高效液相色谱质谱(UPLCMS)联用的方法，对血清中霉酚酸成功进行了分离测定。

　　1 材料与方法

　　1.1 仪器与试剂

　　WatersAcquity型超高效液相色谱质谱系统（配QBA235型TQ检测器，K07UPA468M型Sample Manager，K07UP8 450M型Binay Solvent Manager及Masslynx v4.1色谱管理软件）；色谱柱为Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；MC210S型电子天平（精度0.01 mg）；Abbott Diagnostics，pision离心机；XH86多用途旋涡混合器，Millipore超纯水系统。对照品为霉酚酸对照药（批号：080816，含量99.3%），吲哚美辛内标物（含量大于等于99.3%，批号：100258200403），乙腈、甲醇均为色谱纯（Burdick ＆ Jackson公司）；甲酸（纯度大于或等于86.0%），实验用水均为Millipore超纯水。

　　1.2 方法

　　1.2.1 流动相的配制

　　准确吸取1 mL甲酸于1 000 mL容量瓶中，用超纯水定容，即得0.1 %的甲酸溶液，经0.45 μm的水性滤膜过滤后于室温保存即可。

　　1.2.2 标准溶液的配制

　　精密称取霉酚酸和吲哚美辛0.25 g，用少量去离子水溶解后，再用去离子水稀释至50 mL，配成浓度为5 mg/mL的霉酚酸和吲哚美辛标准储备液，4 ℃冰箱保存备用。取储备液用超纯水梯度稀释至浓度分别为100.00、80.00、60.00、40.00、20.00、10.00、5.00、1.00、0.50、0.10、0.05 μg/mL的标准工作液，4 ℃冰箱保存备用。将吲哚美辛标准储备液稀释至浓度为100.00 μg/mL的工作液，4 ℃冰箱保存备用。

　　1.2.3 血清样品的处理

　　精密移取空白血清0.5 mL，加入内标储备液100 μl，混匀后加入乙腈400 μl，旋涡提取2 min后，于11 266 r/min条件下离心10 min，离心后吸取上清液于另一干燥离心管中，上清液经0.22 μm的滤膜过滤后进样，进样体积为2 μl。

　　1.2.4 色谱条件

　　Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）。流动相为（乙腈加0.1%甲酸）乙腈。梯度法洗脱：乙腈0～4 min内比例由40︰60递增至70︰30，4.1～6 min乙腈比例恢复40︰60。流速为0.2 mL/min，柱温为30 ℃，进样量为2 μl。

　　1.2.5 质谱条件

　　气动辅助电喷雾离子化(ESI)；正离子检测(MRM)；MPA[M+H]离子m/z 321.16，碎片子离子m/z 207.21，碰撞能量25 eV。内标：吲哚美辛[M+H]离子m/z 358.10，碎片子离子m/z 312.12，碰撞能量13 eV。

　　2 结果

　　2.1 分离特性

　　在选定的色谱条件和质谱条件下，分别考察了7个不同来源的空白血清、空白血清加对照品、对照品及实测样品的色谱分离情况。测得霉酚酸质谱图（图1）。由图可见，被测物与内标物两者峰形良好，分离完全，无杂质峰干扰，血样中霉酚酸和吲哚美辛的保留时间分别为1.97 min和3.30 min。

　　另外采用高效液相色谱紫外检测法（HPLCUV）测定血清霉酚酸浓度，并与UPLCMS法比较，结果见图2。HPLCUV测定空白血清有干扰，待测物和内标物未分离。而UPLCMS检测空白血清干扰小，待测物和内标物分离完全，分离特异性好。

　　2.2 标准曲线和线性范围

　　取空白血清480 μl加入不同浓度系列标准溶液20 μl，配制成霉酚酸血清浓度分别为100.00、80.00、60.00、40.00、20.00、10.00、5.00、1.00、0.50、0.10、0.05 μg/mL的霉酚酸血样各两份，按上述血清样品处理方法操作，每一浓度进样2 μl。记录质谱图，以浓度为横坐标，以霉酚酸与内标峰面积比为纵坐标进行线性回归，得回归方程：y1＝0.715569x+0.151809（r=0.997908，leve1=6，n=2，各点RSD<15%），线性范围为0.05～10.00 μg/mL；y2＝0.34927x+4.79164（r=0.990555，leve1=6，n=2，各点RSD<15%)，线性范围为10.00～100.00 μg/mL，血浆中霉酚酸定量下线为0.05 μg/mL（S/N=10，=0.05±0.001，RSD=3%，n＝5）。

　　2.3 回收率试验

　　配制0.1、1.0、10.0、40.0、80.0 μg/mL霉酚酸血样各6份，按照上述血清样品处理方法操作，进样分析，计算低、中、高各种浓度的霉酚酸的方法回收率（n=6）分别为109.8%、117.8%、91.2%、114.2%和98.0%；变异系数分别为6.9%、6.3%、1.5%、3.9%和4.3%。结果表明，低、中、高各种浓度的回收率均符合要求，方法准确可靠。

　　2.4 精密度试验

　　配制0.1、1.0、10.0、40.0、80.0 μg/mL霉酚酸血样各5份，按照血清样品处理方法操作，在1 d内不同时间处理测定，考察日内精密度；连续4 d于同一时间配制0.1、1.0、10.0、40.0、80.0 μg/mL等5种浓度的霉酚酸血样各5份，处理测定，考察日间精密度。计算得低、中、高各种浓度的日内变异系数（n=5）分别为1.5%、2.5%、1.3%、1.0%、3.6%；日间变异系数（n=5）分别为3.7%、4.4%、3.0%、1.6%、2.2%。结果表明日内、日间变异系数在允许范围内，方法精密度良好。

　　2.5 稳定性试验

　　配制0.1、1.0、10.0、40.0、80.0 μg/mL霉酚酸血样各24份，－80 ℃冰箱放置冻存，于0、1、3、5、7、14、21、30 d复管测定。考察冻存稳定性，结果见表1。由表可见，血浆样品可于－80 ℃冰箱至少保存30 d。表1 霉酚酸稳定性试验（略）

　　3 讨论
　　
　　超高效液相色谱（UPLC）是分离分析科学中的一个全新类别，全面提升高效液相色谱（HPLC）的速度、灵敏度及分离度诸品质的同时，保留了其原有的实用性及原理，15 min即可完成全部测定工作，借助质谱（MS）检测高灵敏特点，可满足体内霉酚酸药物浓度测定及相关研究需要。目前，国内多采用高效液相色谱紫外检测法，其灵敏度较低，不利于临床血样有效、快速测定。为了研究HPLCUV与UPLCMS两种方法对霉酚酸浓度测定的影响，本实验分别考察了两种方法的分离特性。结果显示，采用UPLCMS法检测血清中霉酚酸的浓度，空白血清干扰小，待测物和内标物分离完全，分离特异性好。而HPLCUV检测空白血清有干扰，待测物和内标物分离不完全。

　　此外，本实验采用乙腈除蛋白，离心，上清液经0.22 μm的滤膜过滤后直接进样，血样处理方法与文献[8]报道的采用先酸化，再萃取，萃取液用氮气吹干，最后再复溶的多步处理方法比较，大为简化，本实验从处理血样到得到样品图谱时间仅需15 min左右，且进样量低至2 μl，大大减少了取血量，非常适合大样本量分析。实验药在0.05～100.00 μg/mL的浓度范围内线性良好，日内日间变异小，相对回收率大于90%。因此该方法适用于MPA血清浓度的测定，特别是有关霉酚酸体内药代动力学的研究。

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