高迁移率蛋白B1与活化T细胞核因子2协同促进白细胞介素2报告基因转录表达

　　　　 作者：刘辉，姚咏明，丁丽华，王晓辉，袁斌，宋青，叶棋浓，黄翠芬，盛志勇

【摘要】 目的 探讨高迁移率蛋白B1(HMGB1)促进白细胞介素(IL)2转录表达免疫效应的分子机制。方法 构建HMGB1和活化T细胞核因子2(NFAT2)的真核表达质粒，分别单独转染以及共同转染人胚胎肾细胞系293T、人子宫颈癌细胞系Hela，同时转染IL2报告基因，检测IL2报告基因的表达活性。观察当HMGB1与NFAT2质粒共同转染细胞时，是否能协同促进IL2报告基因的活性。结果 在293T细胞中，HMGB1或NFAT2单独转染可提高活性倍数相加为6.8倍，而二者共转时报告基因活性与未刺激对照组相比提高了18.4倍。在Hela细胞中，二者单独转染可提高活性倍数相加为49.9倍，而二者共转时报告基因活性与未刺激对照组相比提高了117.7倍。结论 HMGB1可与NFAT2可协同促进IL2报告基因转录表达。

【关键词】 高迁移率蛋白B1;活化T细胞核因子;白细胞介素2;免疫

　　Abstract: Objective To investigate the molecular mechanism of interleukin(IL)2 production facilitated by high mobility group box1 protein(HMGB1).Methods Eukaryotic expression plasmid HMGB1 and nuclear factor of activated T cells2(NFAT2) were transfected into 293T or Hela cells respectively or simultaneously.Reporter gene activity of IL2 was detected and compared.Coordinate regulation between HMGB1 and NFAT2 was examined.Results Reporter gene activity of IL2 increased by 6.8 times induced by solotransfection of HMGB1 or NFAT2 in 293T cells，while increased by 18.4 times induced by co-transfection of HMGB1 and NFAT2 in 293T cells.On the other hand， reporter gene activity increased by 49.9 times induced by solotransfection of HMGB1 or NFAT2 in Hela cells，while increased by 117.7 times by cotransfection of HMGB1 and NFAT2.Conclusion HMGB1 acts as a coactivator of NFAT2 in promoting IL2 transcription.

　　Key words:high mobility group box1;nuclear factor of activated T cell;interleukin2;immunity

　　高迁移率族蛋白B1(high mobility group box1 protein，HMGB1)是一大类高度保守的非组蛋白DNA结合蛋白，不仅广泛存在于真核细胞的细胞核内，对DNA复制、转录、重组和修复具有重要作用，而且可作为一种新的“晚期”炎症递质由单核/巨噬细胞分泌到细胞外参与炎症反应[1，2]。新近研究表明，HMGB1不仅与创伤后炎症反应密切相关，还可作为一种免疫调节因子引起淋巴细胞激活并释放白细胞介素(IL)2，诱导树突状细胞活化并分泌IL12[3，4]。我们前期实验证实，重组HMGB1可诱导淋巴细胞凋亡，并影响活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells，NFAT)的入核启动基因转录和IL2表达[4]。但是，关于HMGB1以何种机制影响T淋巴细胞合成释放IL2还不明确，其确切信号转导途径尚缺乏研究。由于NFAT2是淋巴细胞内控制IL2表达的关键调控因子[5]，本实验中笔者构建HMGB1和HMGB1的真核表达质粒，与IL2报告基因共同转染细胞系，探讨NFAT2能否介导HMGB1促进IL2表达的免疫效应。

　　材料与方法

　　1 主要试剂

　　真核表达载体pcDNA3、人乳腺文库、大肠杆菌DH5α菌株及含Flag标签的pcDNA3质粒由军事医学科学院八所七室保存;含人全长NFAT2的质粒由华盛顿大学Feng Chen博士惠赠;荧光素酶检测试剂盒、T4噬菌体DNA连接酶及微量质粒提取试剂盒(Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System)购自美国Promega公司;小鼠抗人HMGB1抗体购自美国Sigma公司;免疫发光检测试剂盒购自美国Pierce公司;转染试剂Lipefectmine2000购自美国Invitrogen 公司。

　　2 基因序列

　　在Medline的GenBank数据库中获取人HMGB1的基因全长，基因库登录号为BC066889，其开放读码框从80～727位。NFAT2的基因全长序列在GenBank中基因登录号为U08015，其开放读码框从240～2390位[6]。

　　3 细胞转染

　　培养人肾胚胎细胞系293T以及人宫颈癌细胞系Hela细胞，细胞用含有10%的新生牛血清和双抗DMEM培养基培养。在转染前24小时用不含双抗、含10%新生牛血清的相应培养基将细胞接种在12孔板中，接种量以转染时细胞密度达到90%为准。将DNA用80μl不含双抗和血清的培养基稀释，再用80μl相同的培养基稀释2.5μl Lipofectamine2000，立即将二者混合，室温放置20分钟后，加入到含有0.8ml培养基和10%新生牛血清的12孔板中，4小时后更换培养基。

　　4 荧光素酶和β半乳糖苷酶(βgal)活性测定

　　基本按Promega公司提供的试剂盒说明进行。细胞转染24小时后，裂解细胞离心(12000r/min，10分钟，4 ℃)，取上清液测定荧光素酶活性。

　　采用邻硝基苯βD半乳糖苷测定βgal活性。取上述上清液10μl加入到450μl含有β巯基乙醇(2.7ml/L)的缓冲液中，加入100μl 0.4%的邻硝基苯βD半乳糖苷溶液，37 ℃保温，直到出现浅黄色为止，加入250μl 1mol/L Na2CO3终止反应，在420nm波长下测定样品A值。

　　5 Western blot检测细胞中HMGB1及NFAT2的表达

　　细胞在测定荧光素酶活性时首先用Promega公司的裂解液提取上清，吸取10μl上清，进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳完毕后进行转膜，电转完毕后取出硝酸纤维素膜，应用特异性抗体及带荧光素酶的二抗进行结合。在暗室中，采用化学发光反应试剂盒进行检测。

　　6 实验分组及过程

　　12孔板内的293T细胞生长密度达到90%满足转染要求时，将8孔细胞随机分为4组。每组有2孔细胞，其中1孔不加刺激，另1孔在质粒转染完毕后加入佛波酯A(PMA，终浓度为25ng/ml)+屋诺霉素(Iono，终浓度为0.5μM)刺激[7]。各孔转染的质粒用量为pcDNA3或pcDNA3HMGB1 0.2μg/孔，带Flag标签的真核表达载体(pcDNA3Flag)或带Flag标签的pcDNA3NFAT2真核表达质粒(pcDNA3FlagNFAT2)为0.05μg/孔。所有孔含IL2启动子的NFAT2荧光素酶报告基因质粒(NFAT2luciferase)的用量为0.1μg/孔，βgal的用量为0.05μg/孔，Lipofectamine 2000的用量为1μl/孔，分组如下：第1组为阴性对照，加入对照质粒;第2组为NFAT2转染组，加入NFAT2表达质粒;第3组为HMGB1转染组，加入HMGB1表达质粒;第4组为共转染组，加入HMGB1和NFAT2表达质粒。pcDNA3和pcDNA3Flag为对照质粒，用于阴性组及各组质粒补平。各组转染体系体积为50μl，不足用生理盐水补足。

　　Hela细胞转染时的分组与293T细胞相同，但转染质粒用量稍有增加。各孔转染的质粒用量为pcDNA3或pcDNA3HMGB1 0.4μg/孔，pcDNA3Flag或pcDNA3FlagNFAT2为0.1μg/孔。所有孔的NFAT2luciferase的用量为0.1μg/孔，βgal的用量为0.1μg/孔，Lipofectamine 2000的用量为1.2μl/孔。

　　按照统计学要求，上述各组实验重复4次。

　　7 统计学处理

　　所有试验数据以平均值±标准差(±s)表示，采用stata4.0统计软件，进行单因素方差分析。P<0.05表示有显著性差异，P<0.01表示有非常显著性差异。

　　 结 果

　　1 构建HMGB1及NFAT2真核表达质粒

　　从人乳腺文库中钓取HMGB1全长，克隆到pcDNA3载体中;并从FlagNFAT2质粒中扩增出NFAT2全长，克隆到带Flag标签的pcDNA3载体中，并通过基因扩增、酶切(数据未显示)和蛋白表达鉴定。将pcDNA3HMGB1质粒与FlagpcDNA3NFAT2质粒分别转染293T细胞，用抗HMGB1抗体检测HMGB1蛋白表达，用Flag抗体检测FlagNFAT2融合蛋白表达，并分别设阴性对照。结果显示(图1)，pcDNA3HMGB1质粒与FlagpcDNA3NFAT2质粒在293T细胞中都表达目的蛋白，而阴性对照均未表达。通过以上的鉴定试验，可初步确定HMGB1与NFAT2的真核表达质粒构建正确，最后将2个质粒送测序，测序结果回报，所测序列与GenBank中的基因序列完全相符。

　　2 293T细胞中的活性检测及蛋白表达

　　将构建好的pcDNA3HMGB1质粒与pcDNA3FlagNFAT2质粒分别单独转染以及共同转染293T细胞，同时转染IL2报告基因，检测IL2报告基因的表达活性。观察当HMGB1与NFAT2质粒共同转染细胞时，是否能协同促进IL2报告基因的活性。

　　转染后24小时收集细胞，应用裂解后的上清作活性及蛋白表达检测，结果显示非刺激组活性均无显著增加，只有应用PMA+Iono刺激时可提高报告基因的转录活性。HMGB1、NFAT2单转时提高活性分别为4.4、2.4倍，而共同转染时报告基因活性上升的幅度较大，与未刺激对照组相比提高了18.4倍。(图2、图3)。

　　3 Hela细胞中的活性检测及蛋白表达

　　Hela细胞是宫颈癌细胞系，转染效率比293T细胞稍低，所以转染的质粒用量略有增加。其转染步骤及分组与293T细胞实验组相同。转染后24小时作活性及蛋白表达检测，结果显示HMGB1单转时也可显著提高活性，但不如共同转染时活性上升的幅度大，HMGB1与NFAT2质粒共同转染时报告基因活性可提高117.7倍(图4、图5)。

　　讨 论

　　新近的资料证实，HMGB1可作为机体内一种信号动员免疫系统活化，例如促进树突状细胞成熟、诱导T细胞分泌IL2和干扰素γ从而发生Th1极化[4，8，9]，但HMGB1是通过何种途径促进IL2表达分泌的呢?这方面尚缺乏相应的研究，本实验首次探讨了HMGB1诱导IL2合成释放的分子机制。

　　业已明确，NFATs是淋巴细胞活化中关键的信号分子家族，被T细胞受体信号活化后，转位入核内调控重要基因转录表达。NFAT蛋白在静息状态下位于T淋巴细胞胞浆中，高度磷酸化，活化时被钙调蛋白依赖性磷酸酯酶(calcineurin)作用而发生去磷酸化，移位入细胞核，调节诸如IL4、IL2、IL5、IL13、GMCSF、IL3、TNFα等重要免疫分子的表达[5，10]。迄今为止，NFATs家族已发现有5个成员，包括NFAT1(NFATp，NFATc2)、NFAT2(NFATc1，NFATc)、NFAT3(NFATc4)、NFAT4(NFATc3，NFATx)及NFAT5(TonEBP，tonicity element binding protein，紧张片断结合蛋白)。NFAT14是由钙调节的，与细胞的免疫调节反应关系密切;NFAT5相对原始，是NFATs家族中唯一可在果蝇基因组中找到的，NFAT5在细胞对高张渗透压刺激的信号转导中扮演关键角色。成熟的T淋巴细胞主要表达NFAT1、NFAT2，如果抑制NFAT1/2的水平，淋巴细胞则会基本失去合成释放免疫分子的能力[11]。NFAT14的DBD区(DNA bind domain)都可以与IL2的NFAT启动子区域结合，同时结合激活蛋白(AP)1[12]。

　　研究表明，HMGB1与NFAT2存在一些共同的相互作用蛋白。已证实，HMGB1可作为雌激素受体α(estrogen receptorα，ER)的共激活蛋白促进ER的转录活性，从而启动下游基因转录表达。HMGB1蛋白可以显著促进ER与雌激素反应元件(estrogen response element，ERE)的结合。既往研究表明，NFAT家族成员可与ER直接结合并相互影响信号通路[13]。因此，有理由推测HMGB1可能与NFAT发生直接相互作用。另有资料显示，一种HMGB1/2家族中DNA结合蛋白成员——DSP1(DSP1中含有与HMG序列相似的结构域)，可与Rel同源域家族成员发生相互作用[14]。而NFATs结构中含有Rel相似结构域，结构上的特点提示二者可能直接相互作用。

　　本实验结果显示，无论在293T细胞还是在Hela细胞中，只有当HMGB1与NFAT2共同转染时，才能获得报告基因的最大活性。而且，所获得的最大活性超过了单独转染时所获得活性的简单相加，提示HMGB1和NFAT2可协同促进IL-2报告基因的表达活性。在293T细胞中，二者单独转染可提高活性倍数相加为6.8倍，而二者共转时报告基因活性与未刺激对照组性比提高了18.4倍。同样，在Hela细胞中二者单独转染可提高活性倍数相加为49.9倍，而二者共转时报告基因活性与未刺激对照组性比提高了117.7倍。因此，HMGB1可能通过促进NFAT2的转录活性从而增强IL2的表达释放。此外，本实验应用PMA和屋诺霉素充分活化NFATs，因为PMA可激活丝裂原活化蛋白激酶途径从而活化AP1。AP1是NFATs重要的共作用因子，NFAT14与DNA结合时同时与AP1形成牢固的复合体，共同调控基因转录。屋诺霉素则是钙离子的转运载体，可促进钙离子内流，活化钙依赖性NFATs激活通路。因此，在本实验中我们应用25 ng/ml PMA+0.5μM Iono作为刺激剂，充分活化NFATs，以观察对IL2报告基因活性的影响。

　　已证实，HMGB1可作为多种转录因子的共激活因子，HMGB1可促进雌激素、雄激素及糖皮质激素受体的DNA结合能力，只要加入少量提纯的HMGB1，这些受体结合相应DNA序列的能力就会明显增强。HMGB1可以与某个激素受体、相应的DNA序列形成三元复合体，帮助这些转录因子结构变形，便于与相应的DNA片段相结合，从而成倍的增强激素受体的转录活性。从这一点看，HMGB1所起的作用类似于支架蛋白(scaffold protein)，可帮助DNA片段与转录因子相互结合并处于功能位置。且体外实验证明，HMGB1能与激素受体短暂结合[15]，包括黄体酮激素受体、雌激素受体和雄激素受体等。因此，HMGB1可作为这些转录因子的伴侣蛋白或者伴侣分子，帮助其结合到相应的DNA片段上，一旦完成任务，HMGB1即脱开解构。在这种方式中，HMGB1有可能先与基因序列结合再帮助转录因子结合进来;或者存在另一种作用方式，转录因子先与DNA片段形成复合物，HMGB1接着再加入进来形成蛋白DNA复合物或者蛋白蛋白复合体。然而，在本实验中二者通过何种机制相互作用，其作用位点在哪?笔者将在今后的实验中进一步探讨。

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