作者：王家鹏 唐静 刘柳 杨正梅 吴通奎 殷俊磊
摘要羊痘病毒能引起山羊痘、绵羊痘和牛的结节性疹块病，是所有动物痘病毒中最为重要的一种，严重影响养羊业和国际贸易的发展。从病原学、分子生物学、检测和预防控制等方面对羊痘病毒进行综述，以促进对羊逗病的进一步研究。
关键词羊痘病毒;山羊痘;绵羊痘;P32蛋白;诊断
羊痘又名羊“天花”，是由羊痘病毒引起的一种羊急性、热性、接触性传染病。其特征是发热、无毛或少毛部位皮肤黏膜发生丘疹和疱疹，是所有动物痘病中最为严重的一种，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类重大传染病，我国将其列为一类动物疾病[1-4]。此外，该病在公共卫生方面也受到密切关注，中国、瑞典、印度依据流行病学和临床症状都有人类感染羊痘病毒的报道[2]。世界各国都高度重视该病，感染该病的国家和地区的易感动物及其有关的产品被世界各国列为严格限制进出口的对象。羊痘是所有动物痘病中最为严重的一种，据不同毒株的毒力差异，易感羊群的致死率可达10%~58%或75%~100%不等，羔羊致死率高达100%，妊辰母羊极易流产[3]。受感染的羊群生产力大大降低，毛品质也极大下降，造成巨大的经济损失，严重影响国际贸易和养羊业的发展[1-8]。
1病原的分类及形态特征
羊痘病原为羊痘病毒，可引起山羊痘(Variola caprina;Goat pox;GPV)、绵羊痘(Variola caprina;Sheep pox;SPV)和牛的结节性疹块病(Lumpy skindisease;LSD)[7]，已分离到的肯尼亚和也门毒株既可感染绵羊又可感染山羊，它们同属痘病毒科(poxiridae)、脊椎动物痘病毒亚科(chodopoxvirdae)羊痘病毒属(Capripoxvirus)的成员[7]。该属包括山羊痘病毒(Goatpox virus;GTPV)、绵羊痘病毒(Sheeppox virrus，SPPV)和疙瘩皮肤病病毒(Lumpy skin disease virus;LSDV)3个成员，是惟一在细胞浆内复制的有囊膜的双股DNA 病毒。不同的羊痘病毒间在血清上呈交叉反应，但LSDV一般不感染山羊和绵羊。在电镜下观察，初期的病毒粒子呈卵圆形，大小约为250~350 nm;成熟的病毒粒子多呈卵圆形，大小约为150~180 nm×150~180 nm[7]。在感染细胞内，可形成胞浆包涵体，多呈椭圆形。病毒粒子外层为层管状构造的脂蛋白膜，包围着2个功能不清的侧体以及哑铃型的核酸芯髓[9]。核酸是由双股DNA构成，其分子质量约为130×106~240×106 ku。
羊痘病毒是一种亲上皮性的病毒，大量存在于病羊的皮肤、黏膜及痂皮肉内，病羊血液和鼻黏膜分泌物内也含有该病毒。羊痘病毒在细胞内繁殖，且大部分以裸露的形式留在细胞内，为胞内裸病毒(intracellular naked virus;INV)，有少部分释放到胞外，成为胞外带衣壳病毒(extracellu larenve-loped virus;EEV)。
羊痘病毒对直射阳光、酸、碱和大多数常用消毒药(酒精、红汞、碘酒、来苏尔、福尔马林、石炭酸等)均较敏感，对醚和氯仿也较为敏感。该病毒耐干燥，在干燥的痂皮内能成活数月至数年，在干燥羊舍内可存活6~8月。不同毒株对热敏感程度不一，一般55 ℃下持续30 min即可灭活。放线菌素-D和溴脱氧尿苷可抑制该病毒复制[4]。
2分子生物学特性
绵羊痘病毒(SPPV)和山羊痘病毒(GTPV)基因组约有150 kb，彼此十分相似，约有96%的核苷酸完全相同。和其他痘病毒一样，羊痘病毒基因组包括中间编码区和两端相同的反向末端重复序列(Inverted terminal repeat，ITR)。SPPV和GTPV基因组共有147个开放阅读框(ORF)，编码密度为93%，所编码的蛋白为53~2 027个氨基酸不等。基因组中间的区域(ORFs024-123)有与其他痘病毒同源的保守序列，编码病毒复制所需的蛋白，其功能主要是负责病毒的转录，修饰RNA、病毒DNA的复制以及在胞内组装成熟，在胞外被蛋白膜包裹成成熟的病毒粒子。羊痘病毒DNA的左侧和右侧10、27 kb的基因结构中包含重要的编码功能的基因序列。两端基因序列(ORFs001-23和ORFs124-156)包括1个基因家族(由8个基因组成)及其他与病毒修饰或逃避宿主免疫识别和反应相关的基因，负责编码胞质分裂丝蛋白、表皮生长因子样蛋白(EGF-like protein)、PKR阻遏蛋白、G2蛋白二联趋化因子受体等，还有痘病毒所特有的致病基因和选择宿主范围基因。痘病毒基因组的末端有发夹环结构，这一序列的A+T约为75%，额外的末端重复序列和发夹环结构至少有200 bp。SPPV和GTPV基因组存在一些差异，如末端的ITRs，在SPPV为2 213~2 349bp，而在GTPV为2 198 bp，其纵向重复序列也有差异，在最靠近末端(ORFs001和156)的区域，SPPV含有46bp的ORFs，LSDV包含56bp的ORFs，但GTPV的基因组不含这一纵向末端重复序列。SPPV和GTPV与LSDV的基因组也非常相似，约有97%的核苷酸完全相同，所有的SPPV和GTPV基因在LSDV基因中都存在，在SPPV和GTPV基因组中，有9个与LSDV的毒力和宿主有关的基因缺失，其中包括LSDV独有的基因LSDV 132和类似于编码白介素-1受体的基因，黏液瘤病毒M003.2和M004.1，牛痘病毒F11L、N2L和K7L基因。这些基因的缺失对SPPV和GTPV的宿主范围起很大的影响作用[10]。
3P32蛋白的特性
P32蛋白是目前世界各地分离鉴定的所有羊痘病毒株所共有的且特异性很强的结构蛋白，P32蛋白的体外表达是目前国际上羊痘研究的热点[11-20]。羊痘病毒P32蛋白与晚期H3L基因编码的痘苗病毒的P35蛋白相类似，在成熟胞内病毒粒子的膜上表达，P35蛋白在病毒吸附、成熟病毒粒子的组装、病毒毒力、免疫原性方面发挥着重要作用。GPV P32基因包含969 bp的开放阅读框，编码322个氨基酸;SPV P32基因包含972 bp的开放阅读框，编码323个氨基酸。推导的氨基酸序列表明P32蛋白是高度保守的。P32基因包含1个与膜相关的靠近羧基末端的跨膜区，能被去污剂溶解，在ELISA检测抗体试验中能被用做捕捉抗原[21-29]。免疫印迹研究显示，P32蛋白包含1个重要的抗原决定簇，诱导的抗体反应比其他结构蛋白超前并且优越，不但可以用于诊断技术，还可以用于羊痘的预防。Hosamani M等[16]对几株SPPV和GTPV的P32基因序列的分析结果表明，SPPV和GTPV同源性为97.5%，氨基酸同源性为94.7%。而SPPV P32蛋白的第55位点有1个额外的天冬氨酸，而山羊痘和牛的结节性疹块病的P32蛋白没有此氨基酸，另外，GTPV的P32蛋白的第77、275、403、552、867和964位点有6个特异的核苷酸，GTPV和LSDV也有类似的特异性核苷酸。
4检测技术及基因工程苗的研究
该病仅羊感染发病，根据临床症状，结合其流行病学特征，即可做出初步诊断。但遇非典型病例，实验室确诊就尤为重要。现已有一些对羊痘的实验室检测方法，但各有优缺点。病毒培养和分离虽有较高的特异性，但耗时长;因羊痘病毒和副痘病毒有相似的血清型，一些血清学的诊断方法如间接荧光免疫试验、检测抗体的ELISA等，因会出现抗体交叉反应而无法区分来源于牛、绵羊和山羊的羊痘病毒毒株，也不能区分疫苗免疫与自然感染。又因羊痘感染后主要引起细胞介导免疫，动物接触病原后仅产生低水平的中和抗体，故而病毒中和试验敏感性也不高。周碧君等[7]建立了山羊痘(GP)的5种血清学检测方法并进行比较分析，结果表明，琼脂扩散试验适于基层兽医开展山羊痘病例的诊断，对流免疫电泳能提高对抗原或抗体的分辨能力，荧光抗体试验能对感染细胞进行GTPV定位检测，反向被动血凝试验主要用于临床痘疹痂皮和感染细胞中GTPV抗原的定量测定，正向间接血凝试验(IHA)不失为一种GTPV抗体的最佳监测方法。郭巍等[19]依据P32基因和α微管蛋白基因，初步建立了诊断山羊皮肤组织中GTPV的PCR方法;康文玉等[18]参照SPPV P32基因序列，建立了快速、特异、敏感、可定量、可同时检测大量样品的实时荧光定量PCR技术。郭巍等[19]、马维民等[20]、陈轶霞等[21]进行山羊痘病毒P32基因的克隆与表达，为国内研制羊痘病毒诊断试剂和亚单位疫苗奠定基础。
预防绵羊痘和山羊痘有多种弱毒疫苗和灭活疫苗，灭活疫苗免疫效果不佳，最多只能提供短暂的保护。绵羊和山羊以1株羊痘病毒免疫后，可以抵抗所有毒株的感染，不论感染毒株来源于亚洲或非洲[30-33]。灭活的许多山羊痘病毒株均可作为灭活疫苗广泛使用[34-37]。目前，正在开发新一代GTPV基因工程疫苗，因为GTPV的基因组较大，有表达多个外来基因的潜力，且将外来基因插在羊痘病毒的非编码区，既不影响其复制也不会影响其抗原性，所以以山羊痘病毒基因组作为其他反刍动物病原基因的载体可生产重组疫苗。如将牛瘟病毒、小反刍兽疫病毒基因克隆于羊痘病毒载体，所研制的重组单一疫苗，将对羊痘、牛瘟、小反刍兽疫均有免疫作用[38-41]。
5展望
根据羊痘病毒的宿主特异性，研究病毒基因组与宿主特异性有关的基因序列，依此构建重组疫苗，既可抗山羊痘，又可抗绵羊痘。羊痘病毒作为病毒载体，对传递和表达外来病原体的基因构建多种重组疫苗具有很大潜力。对山羊痘和绵羊痘不同毒株的抗原和基因组特性的研究，尤其对羊痘病毒P32蛋白的研究，为研制新的诊断试剂及羊痘的亚单位疫苗奠定了基础，这将会为诊断、流行病学和有效预防控制该病开辟新的领域。
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