RPHPLC法测定通络止痛贴剂中胡椒碱的含量

　　　　　　　　作者：朱家校，何伟，李勇，马建春

【摘要】 目的 建立通络止痛贴剂中胡椒碱含量测定方法。方法 采用反相高效液相色谱法测定。色谱柱：AkasiLC18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相：乙腈质量分数0.1 %磷酸溶液(体积比40∶60);检测波长：343 nm;柱温：30 ℃;流速：1.0 mL/min。结果 胡椒碱在0.010 0～0.301 2 μg范围内与峰面积线性关系良好，r=0.9999，平均加样回收率为100.62 %，RSD=1.34%。结论 测定方法操作简便、准确，可用于控制通络止痛贴剂中胡椒碱的含量。

【关键词】 通络止痛贴剂;胡椒碱;反相高效液相法;含量测定

　　(Institute of Materia Medica，Guangdong Pharmaceutical College/Guangdong Provincial Key Laboratory of Advanced Drug Delivery，Guangdong Pharmaceutical College，Guangzhou，Guangdong 51006，China)Abstract:Objective To establish a determination method for piperine in Tongluo Zhitong patch. Methods Reversephase HPLC with AkasilC18 column was applied. The chromatographic conditions were as follows:acetonitrile0.1% phosphoric acid solution (40∶60)with a flow rate of 1.0 mL/min，UV detection wavelength at 343 nm，and column temperature at 30 ℃. Results The linear range of piperine was 0.010 0-0.301 2 μg(r=0.999 9) with the average recovery of 100.62% (RSD=1.34 %). Conclusion This method is simple and accurate，and can be used for the quality control of piperine in Tongluo Zhitong patch.

　　Key words:Tongluo Zhitong patch; piperine;RPHPLC; content determination

　　通络止痛贴片处方由荜茇、藁本、冰片等中药组成，具有疏风通络、利窍止痛的功效，临床用散剂外敷治疗偏头痛，疗效确切。本文根据方中药物有效成分的理化性质、药理作用及临床用药特点，将其研制成贴剂。荜茇为本品方中的君药，胡椒碱是该药的主要有效成分，因此，本文采用高效液相色谱法对制剂中胡椒碱进行了含量测定，经方法学研究，胡椒碱在所选用测定条件下能够得到较好地分离，专属性强，阴性无干扰，可作为该制剂的含量控制指标。

　　1 仪器与试药

　　1.1 仪器

　　Dionex ultimate 3000高效液相色谱仪(光电二极管阵列检测器、Chromeleon色谱工作站);BS224S型电子分析天平(北京Sartorius公司);UV1101型紫外分光光度计(上海天美科学仪器有限公司);LXJⅡ离心沉淀机(上海医用分析仪器厂);KQ250E型医用超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)。

　　1.2 试药

　　胡椒碱对照品(批号0775200203，供含量测定用，购自中国药品生物制品检定所);通络止痛贴剂(规格：2.5 cm×2.5 cm，批号：100325、100326、100327，广东药学院药物研究所制备);乙腈为色谱醇;其余试剂均为分析纯。

　　2 方法与结果

　　2.1 色谱条件

　　色谱柱：AkasilC18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相：乙腈质量分数0.1%磷酸溶液(体积比40∶60);检测波长：343 nm;柱温：30 ℃;流速：1.0 mL/min，进样量20 μL;理论塔板数按胡椒碱计应不低于5 000。

　　2.2 样品溶液的制备

　　2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取胡椒碱对照品10.04 mg，加无水乙醇溶解并定容至100 mL量瓶中，作为对照品储备液;精密吸取对照品储备液1 mL，加无水乙醇稀释并定容至10 mL，作为对照品溶液(0.010 04 mg/mL)。

　　2.2.2 供试品溶液的制备 取通络止痛贴剂1贴，除去保护层，剪碎，置干燥具塞磨口瓶中，加体积分数5%冰醋酸无水乙醇溶液25 mL，密塞，超声提取(300 W，45 kHz)30 min，滤过，残渣同法提取两次，合并滤液， 用无水乙醇定容至100 mL， 精密吸取2 mL，加无水乙醇定容至5 mL，摇匀， 用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液作为供试品溶液。

　　2.2.3 阴性对照品溶液的制备 按处方比例制备不含荜菝的阴性样品，按“2.2.2”项方法制成不含荜茇的阴性对照品溶液。

　　2.3 专属性试验

　　分别吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液各20 μL，注入高效液相色谱仪，按“2.1”项色谱条件测定。胡椒碱色谱峰保留时间约为27.4 min，阴性对照品在胡椒碱色谱峰相应位置无干扰峰，对测定无干扰。结果见图1。

　　2.4 标准曲线的绘制

　　精密吸取胡椒碱对照品溶液(0.010 04 mg/mL)1、5、10、15、20、30 μL，注入液相色谱仪，按“2.1”项色谱条件测定胡椒碱色谱峰峰面积，以微克数为横坐标(X)，峰面积积分值为纵坐标(Y)，得回归方程：Y=51.218X-0.1407，r=0.999 9，表明胡椒碱在0.010 0～0.301 2 μg范围内线性关系良好。

　　2.5 精密度试验

　　精密吸取胡椒碱对照品溶液20 μL， 注入液相色谱仪，重复进样6次，测定胡椒碱色谱峰峰面积，RSD为0.323%(n=6)，表明仪器精密度良好。

　　2.6 稳定性试验

　　取同一批号贴剂(批号：100325)，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液20 μL，注入液相色谱仪，测定胡椒碱峰面积，然后分别在0、2、4、8、12、24 h再进样测定。结果表明，供试品在24 h内稳定性良好，RSD为0.599%(n=6)。

　　2.7 重复性试验

　　取同一批号贴剂(批号：100325)5份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样20 μL，测定胡椒碱峰面积，计算含量，胡椒碱平均含量为2.625 mg/贴， RSD为1.334%(n=5)，表明方法重复性好。

　　2.8 回收率试验

　　取干燥具塞磨口瓶9只，平行分为3组，每组分别加入0.525 mg/mL胡椒碱对照品溶液4、5、6 mL(相当于胡椒碱2.1、2.625、3.15 mg)，挥干无水乙醇;另取按处方量制备的不含药物的空白贴剂9贴，除去保护层，分别置于上述磨口瓶中，按照“2.2.2”项下方法制成供试品溶液，进样20 μL测定，并计算回收率，结果见表1。

　　2.9 样品含量测定

　　取不同批号通络止痛贴剂，按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液20 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算胡椒碱含量。结果3个批号(100325、100326、100327)样品中的胡椒碱平均含量分别为2.6171、2.5927、2.6249 mg/贴(n=3)。表1 胡椒碱加样回收率试验结果

　　3 讨论

　　3.1 供试品溶液的制备中，进行了提取溶剂的选择，分别考察无水乙醇[1]、甲醇[2]、乙酸乙酯[3]等溶剂对通络止痛贴剂中胡椒碱的提取率，但几种溶剂提取率均较低，而采用冰醋酸无水乙醇混合溶液作为提取溶剂，胡椒碱有较高的提取率，液相色谱分析无杂质峰干扰。

　　3.2 按照《中国药典》2010版一部荜茇项下含量测定方法[4]，以甲醇水(体积比77∶23)作为流动相，胡椒碱对照品仅出现1个不对称的色谱峰(图2)。经多次试验摸索，以乙腈质量分数0.1%磷酸溶液(体积比40∶60)作为流动相，胡椒碱峰形好，分离度高，胡椒碱对照品色谱图出现3个色谱峰(见图1)。由于胡椒碱对照品色谱图出现了3个色谱峰，使得胡椒碱的定量不准确。本实验根据3个色谱峰峰面积的比例，折算出胡椒碱对照品实际称取量及实际浓度，从而减小了胡椒碱含量测定误差。

参考文献

　[1] 何振梅，徐彦贵，朱静，等.反相HPLC法测定胃痛散胶囊中胡椒碱的含量[J].天津药学，2001(5)：214-215.

　　[2] 姚征，顾建刚，储戟农.高效液相色谱法测定荜芨止痛酊中胡椒碱的含量[J].中国中医药信息杂志，2007，14(12)：43-44.

　　[3] 权丽辉，越淑平，徐丽珍.RP-HPLC测定止痛胶囊中胡椒碱的含量[J].中国中药杂志，2005，30(3)：235-236.

　　[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：219.