PUMA在大鼠胰腺移植缺血再灌注损伤中的意义

　　　　作者：吴娅娜，张克君，崔海宁，王正文，明松林

【摘要】 目的：探讨PUMA在移植胰腺缺血再灌注损伤(I/RI)中的早期促凋亡作用。方法：对封闭群大鼠建立大鼠腔静脉内分泌引流、肠道外分泌引流的动物模型.再灌注后第0、1、2、3、4、6、9、12 h等时点，每时点处死5只大鼠，切取移植胰腺，石蜡包埋切片，原位DNA缺口末端标记(TUNEL)法测定胰腺组织细胞凋亡， Western blot方法测定移植胰腺组织PUMA，bcl2、bax、caspase3蛋白表达。结果：再灌注术后第0、1、2、3、4、6、9、12 h，胰腺细胞凋亡数分别为(29.42±4.93)、(47.65±6.43)、(74.80±9.73)、(106.35±16.80)、(148.71±19.50)、(123.96±15.54)、(97.32±10.60)和(57.42±9.56)个/高倍视野。各时点均显著高于正常胰腺(23.48±4.26)。第4小时细胞凋亡数明显增高，12 h降低到最低值，不同组细胞凋亡数的差异有统计学意义(P&<0.01);PUMA以及其下游的bax和caspase8蛋白表达在第4小时达到最高峰，12 h降低到最高值，bcl2在第4小时达到最低值，蛋白表达差异均有统计学意义(P&<0.05)，以后逐渐升高，12 h降低到最低值，PUMA表达与各时点的细胞凋亡数有明显的正相关(r=1.00，P&<0.05)。结论：I/RI后细胞早期凋亡与PUMA活化有关，PUMA是通过调节下游bax、caspase8、bcl2基因发挥凋亡促进作用。

【关键词】 胰腺移植; 缺血再灌注损伤;凋亡;PUMA蛋白;大鼠

　　[ABSTRACT] Objective: To study the proapoptosis effect of P53 upregulated modulator of apoptosis (PUMA) protein on ischemiareperfusion injury of rats stimulated during pancreatic transplantation.Methods: Rat models of pancreatic transplantation with venacava drainage and enteric drainage were established firstly. Then 5 animals in each group were sacrificed respectively at different time points including 0， 1， 2， 3， 4， 6， 9 and12 h after reperfusion， with pancreatic grafts being removed for apoptosic analysis by using DNA nick end labeling technique and protein expression analysis of PUMA， bcl2， bax and caspase3 by using western blot method. Results: Under high power field， the numbers of apoptosic cells in pancreatic grafts at each time point was 29.42 ±4.93， 47.65 ±6.43， 74.8 ±9.73， 106.35 ±16.8， 148.71 ±19.50， 123.96 ±15.54， 97.32 ±10.6 and 57.42 ±9.56， respectively which are all significantly higher than the number in normal pancreatic tissues (23.48 ±4.26). It indicated the numbers were obviously increased at 4h after profusion while decreased to the minimum at 12h with significant difference among each group (P&<0.01). The expression of PUMA， bax and caspase3 all started to upregulated at 1h after profusion and increased to maximum at 4h， then gradually decreased to minimum at 12h. While for bcl2， the expression started to downregulated at 1h after profusion and decreased to the minimum at 4h， then gradually increased to maximum at 12h. There are significant differences among the protein expression (P&<0.05). Besides， the PUMA expression is positively correlated to the number of apoptosic cells. (r=1.00， P&<0.05). Conclusion: Cell apoptosis in ischemiareperfusion injury is highly correlated to the activation of PUMA. The proapoptosis effect of PUMA is generated by regulating bax， caspase8 and bcl2.

　　[KEY WORDS] Pancreas transplantation; Ischemiareperfusion injury; Apoptosis; PUMA protein; Wistar

　　近年来大量研究表明，细胞凋亡是器官移植缺血再灌注损伤( ischemiareperfusioninjury， I/RI)的早期事件[1]，但细胞发生凋亡的机制不明。PUMA(p53 upregulated modulator of apoptosis)是2001年发现的p53下游促凋亡基因，是bcl2家族BH3亚家族中的成员，PUMA在受到p53缺氧、放射、化疗等刺激信号下迅速被激活，从而导致PUMA下游bcl2家族基因的活性改变，引起细胞色素C的释放和Caspase酶的活化，最终导致细胞凋亡[2，3]。本研究应用大鼠胰腺、十二指肠移植模型， 探讨PUMA在大鼠胰腺、十二指肠移植I/RI中的早期凋亡促进作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　43只(对照组3只)清洁级封闭群SD大鼠(供体)， 体质量250～300 g ，雄性;清洁级封闭群Wistar大鼠， 40只，体质量300～350 g， 雄性， 均由上海实验动物中心提供。

　　1.2 主要试剂

　　鼠抗人PUMA多克隆抗体购自Cell Signals公司，兔抗鼠bcl2 、bax、 caspase3、Actin多克隆抗体和Western bloting试剂购自Santa Cru公司，细胞凋亡检测试剂盒购南京建成生物工程研究所。

　　1.3 大鼠胰腺移植动物模型的制备

　　见文献[4]。

　　1.4 移植模型的分组和处理

　　移植模型共分为8组，每组5只;各组大鼠于胰腺再灌注后取移植胰腺。第1～8组分别于移植后0 、1、 2 、3、 4、6、 9、 12 h进行，取出胰腺立即放入-80 ℃冰箱中保存备用，其中以正常SD大鼠3只做对照。

　　1.5 TUNEL 法显示胰腺细胞凋亡

　　实验方法、结果判断、数据处理参见文献[5]

　　1.6 Westernblotting检测蛋白表达

　　参照《分子克隆实验指南》提取冰冻移植胰腺细胞总蛋白，测定浓度后各取100 μg蛋白，以actin为内参照，Westernblotting检测PUMA、bcl2 、bax、 caspase8蛋白表达。实验步骤按照说明书进行。采用北京赛智创业科技有限公司 ChampGelTM34进行 Western blotting图像定量分析，计算各蛋白与内参actin的比值。

　　1.7 统计学处理

　　采用 SPSS 10.0统计软件包进行统计学分析，数据均数±标准差(±s) 表示。

　　2 结果

　　2.1 手术时间

　　供体手术时间 (47±2) min，袖套准备(2±1) min， 袖套吻合(3±1) min， 热缺血时间(2± 3)min， 受体手术时间(46±3) min，其中动脉吻合(10±2) min，冷缺血时间(52±5) min，与文献[4]的结果一致。

　　2.2 移植胰腺细胞凋亡的检测

　　再灌注术后第0、1、2、3、4、6、9、12 h，胰腺细胞凋亡数分别为(29.42±4.93)、(47.65±6.43)、(74.80±9.73)、(106.35±16.80)、(148.71±19.50)、(123.96±15.54)、(97.32±10.60)和(57.42±9.56)个/高倍视野，正常胰腺细胞凋亡数为(23.48±4.26)个/高倍视野，不同组细胞凋亡数的差异有统计学意义(v=42，t=2.785，P&<0.01)。

　　2.3 凋亡相关基因的分析

　　PUMA、 bax、 caspase8表达自1 h开始表达上调，4 h表达最多，以后表达逐渐减少，12 h表达到最低;而bcl2 表达自1 h开始表达下调，4 h表达最少，以后表达逐渐增多，12 h达到最高，各自的表达差异均有统计学意义(P&<0.05)，见图1。PUMA表达与各时点的细胞凋亡数有明显的正相关( n=5，r=1.00，P&<0.05)。

　　3 讨论

　　吴娅娜，等.PUMA在大鼠胰腺移植缺血再灌注损伤中的意义 实验结果显示，细胞凋亡数自移植灌注后1 h开始明显升高，4 h达到最高，以后逐渐下降，12 h达到最低，这与文献[1，6]的研究结果基本相同，说明细胞凋亡是胰腺移植I/RI后的早期事件。

　　Western blot发现， PUMA在I/RI后4 h表达最明显，以后逐渐下降，12 h后降到最低水平，并且PUMA蛋白表达与细胞凋亡具有明显的正相关， 说明I/RI后早期细胞凋亡与PUMA高度活化有关。与此同时，PUMA下游bax、 caspase8促凋亡蛋白也遵循PUMA的表达变化，而PUMA下游的bcl2抑凋亡蛋白与PUMA的表达规律相反，说明PUMA是通过调节下游的bax、caspase8、bcl2基因发挥凋亡促进作用的。我们的实验提示，抑制PUMA基因活化可能有助于预防I/RI后早期细胞凋亡。该研究为以后的I/RI的防治提供了理论依据。

参考文献

　1 Zhaohui Z， Xi L， Kuiyang L. Apoptosis induced by cold ischemia and Reperfusion after pancreas transplantationin rats[J]. J Digestive Surg，2004，3:278281.

　　2 Yu L， Zhang PM， Hwang KW，et al.PUMA induces the rapid apoptosis of colorectal cancer cells[J]. Mol. Cell， 2001，12(7): 673682.

　　3 Nakano KH. Vousden. PUMA， a novel proapoptotic gene， is induced by p53[J].Mol. Cell，2001，12(7): 683694.

　　4 朱兴国，陈彦，李德春，等.大鼠胰十二指肠移植动物模型的制作[J].中华实验外科杂志，2005，22 (4 ):496497.

　　5 李占京，韩本立，吴军.胰腺移植急性排斥反应中的细胞凋亡[J].中华实验外科杂志，2000，17 (4):335336.

　　6 Drognitz O， von Dobschuetz E， Kisslerb H， et al. Organ procurement in experimental pancreas transplantation with minimal microcirculatory impairment[J]. Eur Surg Res， 2004，36:185219.