作者：邢玉洁，吕安林，王利1，燕学波 于军，曹云新
【摘要】 目的 观察血管紧张素Ⅱ联合5-氮杂胞苷体外诱导骨髓间充质干细胞 (BMMSCs) 定向分化为心肌样细胞的作用。方法 采用密度梯度离心法分离大鼠BMMSCs，取第3代BMMSCs进行分组诱导:血管紧张素Ⅱ组(AngⅡ，终浓度为0.1μmol/L)、5-氮胞苷组 (5-aza，终浓度为10μmol/L)、AngⅡ联合 5-aza组 (终浓度分别为0.1μmol/L与10μmol/L)、空白对照组。诱导24h后更换常规培养液继续培养 4 周。倒置相差显微镜观察细胞的形态学变化，MTT法检测细胞活性及增殖能力，免疫荧光染色法鉴定诱导后BMMSCs中心肌特异性肌钙蛋白 I (cTnI) 的表达，流式细胞计数法计算心肌样细胞诱导率， 透射电镜观察诱导后心肌样细胞的超微结构。结果 原代培养的BMMSCs14天形成集落， 传代细胞体积变大， 诱导后细胞呈长梭形，呈一致性生长， 并出现肌岛样结构。MTT法显示AngⅡ联合 5-aza组细胞增殖能力优于AngⅡ组与5-氮胞苷组。免疫荧光染色结果显示诱导后BMMSCs 表达心肌特异性蛋白cTnI。流式细胞计数法显示：AngⅡ组、5-aza 、AngⅡ联合 5-aza组心肌样细胞诱导率分别为(25.3±2.2)%、(24.6±1.9)%、(30.0±1.7)%，AngⅡ联合 5-aza组心肌样细胞诱导率高于AngⅡ组与5-氮胞苷组(P&>0.05)。透射电镜可见平行排列的肌丝、Z线样物质。结论 血管紧张素Ⅱ联合5-氮杂胞苷可在体外诱导大鼠BMMSCs定向分化为心肌样细胞，其诱导分化率高于单纯5-氮杂胞苷诱导。
【关键词】 血管紧张素Ⅱ; 5-氮杂胞苷; 骨髓间充质干细胞;心肌样细胞
[Abstract] Objective To observe the effect of the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells(BMMSCs) into cardiomyocyte-like cells with 5-azacytidine and angiotensinⅡ.Methods BMMSCs were isolated from bone marrow of SD mouse by density gradient centrifugation. The third passage cells were pided into four groups:AngⅡgroup (0.1μmol/ L)，5-aza group(10μmol/L)，AngⅡ combined with 5-aza group (0.1μmol/L and 10μmol/L)，untreated group as control. After 24h induction， the medium was changed to complete culture medium without any inductor and the cells were culture for 4 weeks. The morphological changes were observed under phase contrast microscope. The effect of AngⅡ and 5-aza on the BMMSCs proliferation was observed with methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay. The cardiomyogenic cells were identified by immunofluorescence staining. The differentiation ratio was examined by flow cytometer. The ultrastructures of the induced cells were viewed with a transmission electron microscope.Results BMMSCs of primary culture formed cell colonies at 14 days. The passaged cells were larger than those of primary culture. After induction， the cells presented long spindle， aligned in parallel and formed “muscle island”- like structure. MTT assay showed that the cell proliferation in AngⅡ and 5-aza group outweighed that of in AngⅡgroup or 5-aza group. The expression of specific protein of cardiac troponin I (cTnI) in induced BMMSCs was positive. Flow cytometer showed that the differentiation ratio in AngⅡgroup，5-aza group and AngⅡ combined with 5-aza group were respectively(25.3±2.2)%，(24.6±1.9)%，(30.0 ±1.7)%， demonstrating that the differentiation ratio in AngⅡ combined with 5-aza group was higher than that of in AngⅡ group or 5-aza group(P&>0.05). Transmission electron microscopy showed that the induced cells had myofilaments， Z line-like substances.Conclusion AngiotensinⅡ combined with 5-Azacytidine can induce the differentiation of BMMSCs into cardiomyocyte-like cells， and the differentiation ratio was higher than that of in 5-aza only.
[Key words] angiotensin Ⅱ;5-azacytidine;bone marrow mesenchymal stem cells;cardiomyocyte-like cells
缺血性心脏病在我国的发病率逐年升高，严重威胁着人类的生存及生活质量。近几年来，细胞移植技术发展迅速，借助此技术可以在坏死部位移植具有收缩功能的细胞，为治疗缺血性心脏病提供了新的方法，也成为治疗缺血性心脏病的研究热点课题。随着研究的深入，选用的靶细胞目前多集中于有多向分化能力的各种干细胞，其中研究的较多的是骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells， BMMSCs)[1]，有研究显示BMMSCs可以被化学物质 5-氮杂胞苷 (5-azacytidine， 5-aza)诱导为心肌样细胞[2，3]。也有研究显示，血管紧张素Ⅱ在体外可能经细胞外信号调节激酶通路诱导人BMMSCs向心肌样细胞分化[4]，提示血管紧张素Ⅱ对BMMSCs的分化发挥重要作用。于是我们设想：血管紧张素Ⅱ联合5-氮杂胞苷共同诱导能否提高BMMSCs向心肌细胞的分化率 ?与单纯血管紧张素Ⅱ及单纯 5-aza的诱导作用相比又有何差别?本实验即通过联合诱导培养，观察血管紧张素Ⅱ联合5-氮杂胞苷对 BMMSCs向心肌细胞分化所起的作用，并与传统诱导分化剂 5-aza比较。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与实验动物 AngⅡ ( Sigma， USA)， 5-azacytidine ( Sigma， USA)，L-DMEM 培养基(Hyclone， USA)，胎牛血清(杭州四季青)， 胰蛋白酶(Sigma， USA)， Ficoll 淋巴细胞分离液(1.077g/ml，TBD公司)， MTT (Sigma，USA)，DMSO (Sigma，USA)，羊抗鼠cTnI抗体(Santa cruz)，FITC标记的抗羊IgG (Boster)，Hoechst33258 (Sigma， USA)。健康SD 大鼠，4周龄，质量80～100g，雄性，由第四军医大学动物实验中心提供。
1.2 方法
1.2.1 BMMSCs的体外分离和培养 颈椎脱臼法处死大鼠，取其四肢长骨，75%酒精浸泡5min。无菌条件下分离出胫骨和股骨，剪除两端骨骺，用不含血清的DMEM培养液冲洗骨髓腔，充分混匀。将细胞悬液缓慢加入含淋巴细胞分离液的离心管中，2000r/min， 离心20min。取中间云雾状有核细胞层， 加入L-DMEM不完全培养液，充分混匀后，1500r/min， 离心10min，弃上清，加入完全培养液，充分混匀后，调整细胞密度为1×106/ml，接种于T-25塑料培养瓶， 37℃含体积分数为0.05的CO2孵箱中饱和湿度培养。3天后首次换液， 除去不贴壁的悬浮细胞，以后每3天换液1次。待细胞长到80%融合时， 用2.5g/L胰蛋白酶进行消化，按1：2的比例进行传代。体外培养至第3代备用。
1.2.2 BMMSCs的诱导分化 将传至第3代的BMMSCs进行分组诱导，共分为4组：(1)AngⅡ组(终浓度为0.1μmol/L);(2)5-aza组(终浓度为10μmol/L);(3)AngⅡ加5-aza组(终浓度分别为0.1μmol/L、10μmol/L);(4)空白对照组， 仅用基本培养基诱导。各组诱导24h后更换完全培养基继续培养，每3天换液1次， 并观察细胞形态变化， 连续培养4周。
1.2.3 形态学鉴定 每日在倒置显微镜下观察诱导前、后细胞生长和形态变化。
1.2.4 MTT法检测细胞活性并描绘细胞增殖曲线 将第3代BMMSC以1×105/ml接种于4个96孔板中， 每块板选取24孔，分为4组，每组6孔，每孔加200μl细胞悬液。培养24h后吸弃孔内培养液，PBS洗涤2次，前3组分别加入含AngⅡ、5-aza、AngⅡ和5-aza的诱导培养液，第4组加入基本培养基作为对照组。诱导24h后各组更换完全培养基继续培养。于培养 1、3、5、7天后进行MTT 检测，每孔加入20μl MTT(5mg/ml)，孵育4h后终止培养。弃孔内上清液，每孔再加入150μlDMSO， 打匀振荡10min，使结晶物充分溶解。选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值(A)，并描绘细胞增殖曲线。
1.2.5 免疫荧光细胞化学检测 将诱导培养1、2、3、4 周的细胞进行爬片，4%的多聚甲醛固定，3%过氧化氢-甲醇室温孵育10min ，正常山羊血清封闭，加cTnI抗体，4℃过夜，PBS冲洗，加FITC标记的二抗，37℃孵育40min，PBS 冲洗，Hoechst33258室温孵育10min，PBS 冲洗，甘油封片，荧光显微镜观察并拍照。
1.2.6 流式细胞计数法 2.5g/L的胰蛋白酶消化收集诱导4周的细胞， PBS调整细胞悬液密度约1×106个细胞 /ml， 滴加羊抗鼠 cTnI抗体，室温 1h，再滴加 FITC标记的抗羊 IgG，室温避光 40min，40g/L多聚甲醛固定 20min。最后流式细胞仪测定 FITC阳性标记细胞占细胞总数百分比。
1.2.7 透射电镜 胰蛋白酶消化收集诱导 4周的细胞，离心后使细胞成团，将细胞团置于3%戊二醛4℃固定2h，3g/L锇酸固定20min，0.1mol/L PBS洗2～3次。梯度浓度丙酮脱水。环氧丙烷+包埋剂(1：1)包埋细胞团块，修块，超薄切片，铜网捞起。铅铀染色，电镜观察。
1.3 统计学处理 所有数据用SPSS 15.0统计软件进行处理，结果(x±s)表示，组间均数比较采用t检验，P≤0.05为差异有显著性。