作者：王银 ，李云鸿 滕鹏 苗珍花，张琳娜，李博
【摘要】 目的观察聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)对早产儿脑室周围白质软化(PVL)小鼠模型及体外培养的少突胶质前体细胞中的热休克蛋白60(HSP60)表达的调控作用。方法建立未成熟小鼠野生型(Wild-type)和PARP-1基因缺失型小鼠脑白质损伤模型，术后取脑，冰冻切片，采用免疫荧光标记法对切片内HSP60进行染色，并在荧光显微镜下观察HSP60的表达。体外培养的少突胶质前体细胞经PARP-1的抑制剂3，4-dihydro-5-[4 -(1-piperidinyl)butoxyl]-1(2H)- isoquinoline(DPQ)或激活剂Etopside预处理，再经IFN-r激活后，应用Western-blot方法检测细胞内HSP60的表达情况。结果在PARP-1基因缺失型小鼠脑白质损伤模型脑中，HSP60的表达量明显高于Wild-type组(P&<0.05)。PARP-1抑制剂DPQ能够明显增强HSP60的表达，而PARP-1激活剂Etopside可显著抑制HSP60的表达。结论PARP-1对HSP60的基因表达具有负调控作用。
【关键词】 热休克蛋白60;聚腺苷二磷酸核糖聚合酶;脑室周围白质软化;少突胶质前体细胞
近年来热休克蛋白60(HSP60)倍受关注， 研究证实[1-4] HSP60 在自身免疫性疾病、传染病、动脉粥样硬化及慢性感染的发病中均发挥着重要的作用。迄今为止，关于HSP60在神经疾病中的作用的报道非常少，尤其是在早产儿脑室周围白质软化(PVL)中的作用还未见报道。PVL是早产儿医学问题中最为棘手的难题之一。PVL的发病机制主要是由于缺血和感染导致脑室周围白质的少突胶质前体细胞(oligodendrocyte progenitor cells， OPC)受损和死亡，致使脑白质内髓鞘不能形成，临床上显现脑瘫和智能落后等后遗症[5-6]。我们前期的研究结果显示HSP60在OPC的损伤中起着重要作用。有报道显示聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)可抑制热休克蛋白70的表达[7]，因此本课题拟利用 PARP-1 基因缺失鼠和PARP-1抑制剂及激活剂来探讨 PARP-1 对 HSP60 的基因调节作用，从而达到抑制或阻断由于 HSP60 导致的 OPC 损伤或死亡通路的目的，为阻断或抑制HSP60对OPC的损伤作用提供分子基础。
1材料与方法
1.1材料
本课题中的动物购自美国Jackson公司，抗HSP60抗体和荧光标记的二抗分别购自StressGen公司和Invitrogen公司，PARP-1的抑制剂3，4-dihydro-5-[4 -(1-piperidinyl)butoxyl]-1(2H)- isoquinoline(DPQ)、IFN-r和Etopside购自Sigma公司。
1.2方法
1.2.1动物模型的制作将4日龄野生型129/Sv小鼠或PARP-1基因缺失小鼠随机分为实验组和假手术组，每组10只。实验组结扎右侧颈总动脉，吸6%氮氧混合气30min，假手术组仅切开颈部皮肤，遂用皮肤胶黏合。术后72h取脑， 固定、包埋、切片，采用免疫荧光标记法对切片内HSP60进行染色，并在荧光显微镜下观察HSP60的表达。
1.2.2OPC的分离和培养取1日龄的新生野生型小鼠脑，去除结缔组织和血管，机械捣碎并通过70μm网筛过滤;分离的细胞种植到多聚赖氨酸包被的培养瓶中;培养于含20%小牛血清的DMEM培养液中，37℃，5%CO2恒温箱培养。每3天换1次细胞液。2周后，利用摇床振荡法分离纯化OPC，分离的OPC种植到6孔板，培养液为含有N2， 10μg·mL-1PDGF 和 25μg·mL-1bFGF 的无血清DMEM溶液。第2天，用20 μM DPQ或Etopside分别 处理OPC 1h，然后在细胞液中加入IFN-γ (1μg·mL-1)，孵育30min，吸掉细胞液，加入细胞裂解液裂解细胞，收集，用Western-blot法检测细胞中HSP60的表达。
1.3统计学方法各实验组间比较用单因素方差分析(one way ANOVA)，P&<0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1PARP-1在体内对HSP60表达的调控
采用免疫荧光标记法观察到，在PARP-1-/-实验组中，HSP60的荧光数量和强度明显高于野生型对照组(P&<0.05)，见图1(封3)。
2.2PARP-1在体外对HSP60表达的调控
分别用PARP-1 抑制剂DPQ或激活剂Etopside处理，再用IFN-r激活的OPC，Western-blot结果显示经DPQ处理的OPC，HSP60的表达显著增加(P&<0.05)，相反，经Etopside处理后，HSP60的表达被抑制了(P&<0.05)，见图2。图2PARP-1抑制剂DPQ和激活剂Etopside对HSP60在OPC中表达的调控作用
3讨论
热休克蛋白是一组具有重要生理功能、进化上高度保守的蛋白质分子家族。HSP60是近些年研究的热点。 研究证实[8]HSP60 对细胞凋亡具有双重作用。在生理状态下，HSP60 主要通过与凋亡相关因子的相互作用以及减少线粒体产生氧自由基而发挥抗凋亡效应[8-9]。作为分子伴侣蛋白，HSP60 能够维护抗凋亡因子的正常构象和功能、抑制促凋亡因子激活。在病理状态下，HSP60 表达水平和亚细胞定位发生变化，可产生促凋亡效应[8-10]。HSP60在细胞凋亡中的双重作用已成为人们研究的热点。但是迄今为止，对HSP60在疾病中对细胞凋亡的作用及其调控机制，尤其是在神经系统疾病中的作用的报道还很少，因此研究HSP60基因表达的调控机制，对抑制OPC的损伤，进而防治PVL将具有非常重要的意义。
PARP-1自1966年被发现以来，其在DNA损伤修复和维持基因组稳定性方面的重要作用引起广大学者的广泛关注。体内和体外的研究表明抑制PARP-1则可降低DNA的修复功能，增强放疗和化疗对肿瘤的治疗效果[11]。目前PARP-1抑制剂已经进入抗肿瘤药物I期临床研究，PARP-1有望成为肿瘤治疗的一个新靶点。
本研究的体内和体外的实验结果显示，在PVL动物模型中，当PARP-1基因缺失时，HSP60 的表达显著提高。当PARP-1被DPQ抑制时，HSP60的表达明显增强，而当PARP-1被Etopside激活后，HSP60的表达显著降低。这些结果表明，PARP-1对HSP60的基因表达具有负调控作用。因此，在PVL中，可以通过激活或抑制PARP-1来调控HSP60的表达。本研究对进一步认识 HSP60 在神经系统疾病中的作用，为预防和治疗 PVL 提供了一条新的思路。
参考文献
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