作者：徐华， 纳春祥， 李桂忠， 曹军
【摘要】 目的观察表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechingallate， EGCG)对大鼠血管平滑肌细胞钙化的影响。方法 制备β-甘油磷酸盐诱导血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells， VSMCs)钙化模型。实验分为4组：对照组、钙化组、单纯EGCG组及EGCG 干预组(又分为10-7、10-6、10-5和10-4 mol·L-1的EGCG 4个亚组)。Von Kossa染色观察细胞钙化情况，生化试剂盒比色法测定钙含量及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase， ALP)活性。结果 VSMCs钙化组Von Kossa染色见平滑肌细胞内和细胞间基质有大量黑色颗粒聚集;与对照组比较，钙化组VSMCs钙含量、ALP 活性均有明显增加;10-7~10-4mol·L-1 EGCG干预组VSMCs钙含量、ALP 活性呈剂量依赖性有显著降低。结论 EGCG具有抑制VSMCs钙化的作用。
【关键词】 表没食子儿茶素没食子酸酯;血管钙化
绿茶及其主要提取物表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechingallate， EGCG)可延缓动脉粥样硬化的形成和发展，降低动脉粥样硬化的危险 [1-2]，且能够抑制由血管紧张素Ⅱ(angiotensin II， Ang Ⅱ)诱导的c-Jun mRNA的表达，使c-Jun氨基端激酶(JNK)的激活受阻，从而抑制由AngⅡ刺激产生的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells， VSMCs)肥大，防治心血管疾病(高血压、动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄等)[3]。本研究组已证实[4]，绿茶可明显减轻大鼠血管钙化模型的钙化程度，且绿茶抑制钙化的效应可能部分与干预血浆和血管组织的AngⅡ系统有关。但绿茶主要提取物EGCG与血管钙化之间的关系迄今未见报道。本研究拟在制备大鼠血管平滑肌细胞钙化的模型上，观察EGCG对血管钙化的影响，以探讨EGCG对血管钙化的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
雄性Sprague-Dawley大鼠150～180g，由宁夏医科大学实验动物中心提供。β-甘油磷酸钠、DMEM、胰蛋白酶及EGCG购自Sigma公司;胎牛血清购自武汉三利生物制品厂;碱性磷酸酶、钙测试盒购自南京建成生物技术有限公司;其余试剂均为市售分析纯。
1.2 原代大鼠血管平滑肌细胞培养
1.2.1 取材及培养材料的制备 ①取大鼠，胸腹部备皮，环枕关节脱臼后，消毒、开胸，暴露并分离主动脉至腹主动脉肾动脉分支处。②将分离出的动脉，置入预先加有培养液的无菌培养皿中，清洗，剥除外膜的纤维脂肪层。③纵向剖开血管，内膜面向上，用刀片刮内膜1～2次。④小心撕下近内膜面的中膜层，浸泡在含10%胎牛血清的DMEM培养液内，将血管条剪成1 mm×1 mm的小块。
1.2.2 原代血管平滑肌细胞接种与培养 用吸管将小块组织吸出注入培养瓶中，在瓶底壁上摆置均匀，以小块间距离0.5 cm为宜，轻轻翻转培养瓶，瓶底朝上(注意勿使组织块流开)，加入培养液，37℃，5% CO2培养。
培养2～4h后慢慢翻转培养瓶，令液体缓缓覆盖组织小块，注意勿使组织小块从瓶壁上冲掉，再继续培养约5d，可见平滑肌细胞从组织块的断面中长出，待接近长满瓶底85%时即可传代。
1.3 大鼠血管平滑肌细胞钙化模型的制备及实验分组 参照文献[5]组织块贴壁法培养大鼠VSMCs，培养液为含15%(v/v)胎牛血清的DMEM，细胞呈梭形及典型的“峰谷”状生长，成“峰”部位细胞密集多层生长，而成“谷”部位细胞密度相对较少，α-actin免疫组化染色阳性证实培养的细胞为VSMCs。实验用5~8代细胞，将细胞按1×105个·孔-1接种于24孔培养板，每组6孔，分为：①对照组(CON)：单纯DMEM培养基(含15%FBS，下同)培养;②钙化组(VDN)：培养基中加入10-3 mol·L-1的β-甘油磷酸盐;③EGCG组：培养基含10-4 mol·L-1的EGCG;④钙化+EGCG组(VDN+EGCG)：在钙化培养液中分别加入10-7、10-6、10-5和10-4 mol·L-1的EGCG，共分四个亚组。每2天换液1次，10d后收集细胞做下述测定。
1.4 血管平滑肌细胞Von Kossa染色[5]
参照文献[5]的方法制作细胞爬片，孵育结束后将培养的细胞放入4℃，4%的多聚甲醛溶液中固定45 min，蒸馏水清洗后将玻片放入5%的硝酸银溶液中，在紫外灯下照射30 min，经2.5%的硫代硫酸钠溶液定影处理5 min后，碱性品红返染，脱水、透明、封片，于光镜下观察。
1.5 血管平滑肌细胞总钙含量[6]和碱性磷酸酶(ALP)活性测定
细胞培养结束后用冷的PBS洗3次，用刮刀把细胞刮入200 μL 的溶解缓冲液(0.2%NP-40溶于10-3 mol·L-1 MgCl2)中，使用超声波破碎(功率40 W)，样品试管置入冰水中，破碎10s，暂停10s，共6次，破碎效果用显微镜证实，然后离心(4℃，3500 r·min-1，10 min)，取上清液。用生化试剂盒比色法进行细胞钙含量及ALP活性测定。
1.6 统计学方法
数据以均数±标准差表示(±s)，两样本均数间比较采用t检验，多样本均数间比较采用One-way ANOVA检验，组间的两两比较采用Student-Newman- Keuls(SNK)方法检验，以P&<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 血管平滑肌细胞Von Kossa染色
正常大鼠VSMCs呈梭形，贴壁正常，无钙沉积现象(图1A，见封3)。β-甘油磷酸盐诱导的钙化VSMCs生长9～11d后，细胞聚集呈菊花状的结节，胞内及细胞间质可见大量钙沉积(黑色颗粒沉积)，部分聚集成团并形成钙结节(图1B，见封3);而经不同浓度的EGCG处理后的钙化VSMCs钙沉积明显减少(图1C~F，见封3)。
2.2 血管平滑肌细胞钙含量的变化
与对照组比较，β-甘油磷酸盐诱导的VSMCs钙化组，其细胞总钙含量高1.81倍(P&<0.01)。
与β-甘油磷酸盐钙化组相比，EGCG 10-6、10-5和10-4 mol·L-1与β-甘油磷酸盐共同孵育减少其诱导的细胞钙含量，分别低15.59%、37.45%和43.72%(均P&<0.01)，其相关分析见图2。
2.3 血管平滑肌细胞碱性磷酸酶的变化
VSMCs钙化组ALP活性较对照组高3.08倍(P&<0.01)，见表1。EGCG(10-7、10-6、10-5和10-4mol·L-1)呈浓度依赖性降低β-甘油磷酸盐诱导的钙化VSMCs 的ALP活性，与钙化组比较，分别低10.59%(P&<0.05)、25.32%、31.65%和45.94%(均P&<0.01)，其相关分析见图3。表1 VSMCs钙含量、ALP活性变化(±s，n=6)
3 讨论
本实验用β-甘油磷酸钠诱导大鼠VSMCs钙化[5]，引起大鼠VSMCs总钙含量增加，ALP活性增强，Von Kossa染色可见VSMCs内有大量钙沉积及钙结节形成等典型血管钙化表现，与文献报道一致[6]，表明VSMCs钙化模型建立成功。
在离体培养的β-甘油磷酸盐诱导的VSMCs钙化模型上，用绿茶的主要提取物EGCG进行干预，呈浓度依赖性降低VSMCs的ALP活性，减轻细胞钙超负荷;本实验条件下，随培养用EGCG浓度的增加，VSMCs钙化程度逐渐减轻。以上结果提示EGCG具有抑制VSMCs钙化的作用。研究已证实，绿茶干预血管钙化的效应与下调血浆和血管组织的AngⅡ有关[4]，而EGCG抑制血管钙化效应是否与AngⅡ下调有关，及与其他钙化调节因子如肿瘤坏死因子、尾加压素等的关系值得进一步研究。
参考文献
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[2] Bursill CA， Roach PD. Modulation of cholesterol metabolism by the green tea polyphenol (-)-epigallocatechin gallate in cultured human liver (HepG2) cells[J]. J Agric Food Chem， 2006， 54(5): 1621.
[3] Zheng Y， Song HJ， Kim CH， et al. Inhibitory effect of epigallocatechin 3-O-gallate on vascular smooth muscle cell hypertrophy induced by angiotensin II[J]. J Cardiovasc Pharmacol，2004， 43(2): 200.
[4] 徐华， 万定， 杨晓明，等. 绿茶对实验大鼠血管钙化的影响[J]. 宁夏医学院学报，2008， 30(4): 424-426.
[5] Tintut Y， Parhami F， Bostrom K， et al. cAMP stimulates osteoblast-like differentiation of calcifying vascular cells. Potential signaling pathway for vascular calcification[J]. J Biol Chem， 1998， 273 (13): 7547-7553.
[6] Li J， Chai S， Tang C， Du J. Homocysteine potentiates calcification of cultured rat aortic smooth muscle cells[J]. Life Sci， 2003， 74 (4): 451-461.