【摘要】 ：目的 研究HBV感染者血清及外周血单个核细胞（PBMC）中HBV-DNA的感染情况。方法 采用荧光定量PCR技术对112例乙肝患者PBMC及血清中HBV-DNA的感染情况进行检测。结果 PBMC内HBV-DNA阳性60例，阴性52例；PBMC内HBV-DNA阳性患者HBeAg阳性率68.3% ，较PBMC内HBV-DNA阴性患者显著增高（P＜0.05）；血清和PBMC检测结果一致的患者占总检出率的79.5%。肝硬化组PBMC内HBV-DNA阳性率高于急性乙型肝炎组和慢性肝炎组（P＜0.05）。结论 血清与PBMC内HBV-DNA阳性率以及HBeAg阳性率存在明显的相关性。PBMC中HBV-DNA的持续存在可能与乙肝易慢性化有关。
【关键词】 乙肝病毒；肝硬化；HBV-DNA；外周血单个核细胞
Abstract：Objective To explore the relationship between infection rates in serum and Peripheral Blood.Mononuclear Cells (PBMC) in HBV patients. Methods HBV infection in serum and PBMC were Monitored by PCR fluorescent quantification technique. Results In 112 HBV patients， 60 were found HBV-DNA positive in PBMC. In those cases with HBV-DNA positive in PBMC， 68.3% were HBeAg Positive， that was significantly higher than those HBV-DNA negative in PBMC(P＜0.05). The same result in both.serum and PBMC occurred in 79.5% of all cases. PBMC infection rate in liver. sclerosis patients was significantly higher than that in acute HBV and chronic HBV (P＜0.05). Conclusion There is a high correlation among the HBV-DNA positive rates in serum and PBMC and the positive rate of HBeAg. The continuous existence of HBV-DNA in PBMC of HBV patients may play a significant role in the disease mechanism.
Key words:HBV virus; PBMC; HBV-DNA; sclerosis
乙型肝炎的发病是乙型肝炎病毒（HBV）与机体相互作用的结果，与HBV引起宿主细胞的免疫病理损伤有关。HBV能感染外周血中单个核细胞（PBMC）并能在细胞内复制。HBV侵入人体后，机体免疫系统有可能及时清除血液中HBV，但PBMC中HBV不易被清除而持续存在，可导致免疫功能异常引起肝病慢性化。探讨PBMC中HBV-DNA存在情况和含量变化对阐明HBV入侵PBMC及慢性化机制有重要意义。
1 材料与方法
1．1 病例选择
我院2008年1-6月收治的住院患者112例，男79例，女33例，年龄15～65岁，平均（31±22）岁。病程6～106个月。诊断符合西安会议修订的《病毒性肝炎防治方案》诊断标准［1］，其中慢性乙型肝炎（CAH）57例，乙型肝炎肝硬化（LC）36例，急性乙肝（AHB）19例，均排除甲、丙、丁、戊型肝炎。采用荧光定量PCR技术对上述肝病患者外周血PBMC及血清中HBV-DNA的感染情况进行检测。
1．2 试剂和仪器
采用美国PE公司荧光定量PCR仪（GENEAMP 5700 Sequence detection system）、净化公司超净工作台、北京医用离心机厂低速离心机、日本日立公司SANYO型低温冰箱、美国贝克曼自动生化分析仪。TagDNA聚合酶购自晶美生物制品公司，荧光定量试剂盒购自深圳达安基因公司。
1．3 外周血PBMC内HBV-DNA检测(单个核细胞HBV-DNA)
无菌采集空腹静脉全血5mL放入含EDTA2Na抗凝试管中，常规Ficoll梯度离心法分离外周血单个核细胞。为排除血清污染、最后一次洗涤液留送PCR法检测HBV-DNA。离心10000r/min，留取沉淀物，-20℃保存，PBMC沉淀和末次洗涤液分别加入50μL DNA提取液混匀，100℃沸水浴10min，转至4℃静置6～8h，离心5min，取上清液5μL做PCR反应。
1.4 血清HBV-DNA检测
参照试剂盒说明书进行。直接吸取血清50μL，加等量的DNA提取液混匀，100℃沸水浴10 min，转至4℃静置6～8h，离心5min，取上清液5μL做PCR反应。
2 结果
2.1 乙肝患者PBMC及血清中HBV-DNA的检测结果
见表1。血清和PBMC检测结果一致的患者占79.5%（89/112）。随着病情加重，由急性肝炎→慢性肝炎→肝硬化患者血清内HBV-DNA阴性而PBMC内HBV-DNA阳性所占的比例有上升趋势。表1 各型乙肝患者血清中与PBMC中HBV-DNA检出情况(略)
2．2 外周血单个核细胞内HBV-DNA与HBeAg的关系
见表2。表2 外周血单个核细胞内HBV-DNA与HBeAg的关系（略）
2．3 各组PBMC及血清HBVDNA检测与临床分型关系
见表3。表3 各组PBMC及血清HBV-DNA检测与临床分型关系（略）
3 讨论
乙肝病毒是嗜肝性的、非肝细胞毒性病毒。HBV-DNA［2］存在于HBV感染肝细胞内，其次是外周血单个核细胞。本实验运用荧光定量PCR技术检测了各型乙型肝炎患者血清和外周血单个核细胞中HBV-DNA的水平。表1所示各组乙肝患者其血清和PBMC中HBV-DNA检测一致的达79.5%，即PBMC和血清中HBV-DNA变化呈一致性趋势，说明血清和PBMC中HBV-DNA阳性率有相关性，与有关报道一致［3］。随着病情加重（由急性肝炎→慢性肝炎→肝硬化）患者血清内HBV-DNA阴性而PBMC内HBV-DNA阳性所占的比例有上升趋势，肝硬化组达36.1%，这可能与HBV长期存在于PBMC和肝细胞中增加了HBV整合的机会有关。HBV-DNA可能是肝病患者发生肝硬化的高危因素［4］，故检测PBMC内HBV-DNA是对血清HBV-DNA的一个重要补充。
一般认为血清HBV-DNA和HBeAg是病毒复制的指标。HBeAg持续阳性表明存在HBV活动性复制。而部分患者由于HBV前C区基因变异，导致不能形成HBeAg。由表2所示112例乙型肝炎患者PBMC内HBV-DNA阳性60例、阴性52例，PBMC内HBV-DNA阳性患者HBeAg(+)阳性率68.3%，较PBMC内HBV-DNA阴性患者显著增高，说明血清HBeAg阳性可反映HBV在细胞内活跃性复制。但有学者［5］发现一些血清HBV标志物阴性的患者在其外周血PBMC 中或肝组织中可检测到HBV-DNA，可能与上述变异有关。说明即使HBeAg阴性或治疗后HBV-DNA转阴的患者，其外周血PBMC仍可存在血清HBV-DNA，并不意味HBV-DNA彻底清除。
各组PBMC及血清HBV-DNA检测与临床分型关系提示，血清和外周血PBMC内HBV-DNA阳性率肝硬化组＞慢肝组＞急性肝炎组，可能与PBMC内HBV持续存在有关。当血清中HBV被清除后，PBMC仍可提供HBV，使HBV在体内长期存在，造成肝细胞反复感染。各组PBMC内的HBV-DNA定量值是：慢肝组＞肝硬化组＞急性肝炎组，可能与慢性肝炎活动期、病毒活跃性复制及整合有关。血清HBV-DNA定量为：慢肝组＞肝硬化组及急性肝炎组，肝硬化组及急性肝炎组组间差异无统计学意义。目前已有研究表明外周血单个核细胞已成为HBV肝外重要复制场所。Bartolome等发现肝组织HBV与PBMC内HBV-DNA的存在之间有直接关系。无论患者是否经抗病毒治疗，当肝HBV消失时，带有HBV-DNA的PBMC数量减少。出现这种相关的内在机制目前尚不清楚。
血清HBV-DNA检测对于HBV暂不释放入血的肝内外感染不易检出，肝组织HBV-DNA检测因肝活检标本不易获得亦限制了其常规应用。PBMC中的HBV－DNA检测能间接反映肝细胞内HBV-DNA的存在情况，对乙肝患者体内病毒的复制状态有更准确的评价，可对肝病抗病毒治疗起指导作用。
参考文献
［1］全国第十次病毒性肝炎及肝病学术会议纪要［J］.中华传染病杂志，2001，19：53.
［2］李咏梅，崔秋美，王如刚，等.乙型肝炎病毒感染外周血单个核细胞的临床意义探讨［J］.齐鲁医学检验，2003， 14(3)：51-52.
［3］宓余强，粱树人，张弘.慢性乙型肝炎外周血单个核细胞内HBV-DNA与血清HBV-DNA及HbeAg表达关系的研究［J］.中华实验和临床病毒学杂志，2007， 21(3)：261-263.
［4］Leung N，Tam J，Lau G， et al.Hepatitis B virus DNA in peripheral blood leukocytes: a comparision between hepatocellular carcinoma and other hepatitis B virus related chronic liver disease ［J］.Cancer，2001，73(1):1143-1144.
［5］Bartolome J， Moraleda G，Molina J. Hepatitis B virus DNA in liver and peripheral blood mononuclear cells during reduction in virus replication［J］. Gastroenterology，1990，99:1745-1750.