壳聚糖对肝癌和肺癌细胞株糖基化作用的影响

　　　　 作者：沈力， 闫 石， 吴祁生， 吴士良

【摘要】 目的： 观察中药壳聚糖对肝癌和肺癌细胞株糖基转移酶表达的影响，探讨中药多糖在肿瘤预防和治疗的应用。方法： 以浓度为50，100和200 mg/L的壳聚糖分别作用于肝癌细胞株SMMC7721和肺癌细胞株A549，采用RTPCR方法检测多肽：N乙酰氨基半乳糖转移酶2（ppGalNAcT2）和β3GalT7的表达水平。 结果： 肝癌细胞株中ppGalNAcT2和β3GalT7仅微弱表达，加药后作用不明显；肺癌细胞株中ppGalNAcT2和β3GalT7均有所表达，加入不同浓度的壳聚糖之后，ppGalNAcT2和β3GalT7的表达均受到抑制，且随着壳聚糖浓度的增加，抑制作用越明显。结论： 肝癌细胞株SMMC7721和肺癌细胞株A549 ppGalNAcT2和β3GalT7的表达不同，壳聚糖能够抑制肺癌细胞株A549中的糖基转移酶ppGalNAcT2和β3GalT7的表达，从而抑制了糖基化作用，对肺癌的预防和治疗具有一定的价值。

【关键词】 壳聚糖； 肝癌； 肺癌； 糖基转移酶

　　［Abstract］ Objective: To observe the effect of chitosan to the expression of different glycosyltransferases in liver cancer cell line and lung cancer cell line and to study the application of chitosan in preservation and treatment of tumor. Methods： Detect the expression of ppGalNAcT2 and β3GalT7 in SMMC7721 cell line and A549 cell line by RTPCR after chitosan added to the culture medium.The concentration of chitosan was 50，100，200 mg/L. Results： The mRNA expression of ppGalNAcT2 and β3GalT7 was in low lever in SMMC7721 cell line and the action was not obvious.The mRNA expression of ppGalNAcT2 and β3GalT7 in A549 cell line was decreased after chitosan added to the culture medium.As the increased of concentration， the inhibition was stronger. Conclusion： This study showed that the expression of ppGalNAcT2 and β3GalT7 in SMMC7721 cell line and A549 cell line was different.The glycosylation in A549 cells was inhibited by the chitosan through inhibiting the expression of ppGalNAcT2 and β3GalT7.It was good for preservation and treatment of lung tumor.

　　［Key words］ chitosan；liver cancer; lung cancer；glycosyltransferase

　　中药多糖广泛存在于植物、微生物(细菌和真菌)和海藻中，具有极大的医学应用价值。壳聚糖是采用甲壳素作为原料， 通过脱乙酰后制成的一种天然生物高分子， 是生物界大量存在的线性氨基多糖，具有广泛的药理作用，譬如抑菌作用，调脂及调节血糖作用，抗凝血作用等等。近年来有文献报道壳聚糖具有极佳的抗肿瘤作用，并且无毒副作用［1］。

　　肿瘤细胞糖蛋白糖链结构异常与肿瘤的生物学行为，如恶性转化、转移与浸润等密切相关，而其基础是糖基转移酶的变化。因此，研究肿瘤细胞的糖基转移酶变化，有助于了解肿瘤的生物学行为机制，利于肿瘤的治疗和预防。本文观察了不同浓度壳聚糖对肝癌和肺癌细胞株糖基转移酶表达差异，以探讨糖基转移酶与肿瘤细胞浸润转移能力的关系，以及壳聚糖在肿瘤治疗和预防中的作用。

1 材料和方法

　　1.1 试 剂

　　Trizol，MMLV逆转录酶，dNTP MIX， 5×MMLV 缓冲液，10×PCR 缓冲液，MgCl2等均购自Invitrogen 公司，六碱基随机引物购自TaKaRa 公司，TaqDNA 酶购自上海捷瑞生物科技有限公司。

　　1.2 细胞培养及分组

　　肝癌细胞株SMMC7721和肺癌细胞株A549均为本室保存。壳聚糖胶囊由中科院大连化学物理研究所提供，溶于无血清的RPMI1640培养基，0.22 mm孔径的滤膜过滤除菌，4℃放置备用。

　　SMMC7721和A549用含10％小牛血清的RPMI1640培养基，置37℃，5％CO2培养箱内培养，生长至对数生长期时进行细胞分组。细胞分成4组，第1组，即对照组，加入1 ml的培养基；第2组，加入等体积50 mg/L的壳聚糖；第3组，加入等体积的100 mg/L的壳聚糖；第4组，加入等体积的200 mg/L的壳聚糖。然后加入相同体积的培养基继续培养24 h。

　　1.3 RTPCR

　　RTPCR法检测SMMC7721和A549细胞中ppGalNAcT2，β3GalT7的表达：将培养瓶中的细胞用PBS洗2次， 1 500 r/min离心5 min后弃上清，保留细胞，Trizol法提取总RNA。取总RNA 2 μg进行逆转录反应，再进行PCR扩增。扩增产物以2%的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，图像分析仪摄像并分析结果。PCR反应体系(50 μl)，反应条件： 94℃预变性3 min；循环：94℃变性45 s， 56℃复性1 min， 72℃延伸1 min，循环数30；72℃延伸7 min。引物设计采用Genetyx软件，并经GenBank Blast进行同源检索后合成。引物由上海Invitrogen公司合成：

　　βactin引物为：F：5′CTCGTGCTACTCTCTCTTTC3′，R：5′CATGTCTCGATCCCACTTAAC3′，预期扩增产物长度为211 bp。

　　ppGalNAcT2 引物为：F：5′GAAAGAATTAGGAAGGGTCAGAAC3′，R：5′CTGTGTCAATGTAAACATAGCTC3′，预期扩增产物长度为668 bp。

　　β3GalT7引物为：F：5′ TATGTGCCCGAGTCCTTCTTCG3′，R：5′ GCAGTTGTTTCCAGAGCCGAATG3′，预期扩增产物长度为303 bp。

2 结 果

　　2.1 不同浓度壳聚糖对肝癌细胞株SMMC7721 ppGalNAcT2和β3GalT7表达的影响

　　虽然肝癌细胞的βactin有所表达，但检测不到ppGalNAcT2和β3GalT7表达，在加入不同浓度的壳聚糖之后，仍未见到ppGalNAcT2和β3GalT7的表达，可见壳聚糖对两者的表达没有促进或者增强作用。见图1。

　　2.2 不同浓度壳聚糖对肺癌细胞株A549 ppGalNAcT2和β3GalT7表达的影响

　　肺癌A549细胞株中ppGalNAcT2和β3GalT7均有表达，且随着壳聚糖浓度的增加，表达量均有所降低。说明壳聚糖对ppGalNAcT2和β3GalT7的表达有一定程度的抑制作用。见图2，图3。

3 讨 论

　　所有生物的细胞表面均覆盖着反映细胞种类和状态的糖链。细胞癌变过程中总伴有糖链结构的改变，导致构成癌细胞膜的糖脂质和糖蛋白改变，而糖链的改变又使细胞间的识别和联系发生障碍。糖链是按一定顺序由糖基转移酶合成的。肿瘤发生中许多糖基转移酶的表达水平或活性都发生改变，从而影响细胞的周期调控和细胞的增殖能力，促进肿瘤的发展。糖基化是真核细胞蛋白质转录后修饰方式中的一种。这些糖蛋白与一系列的生物学功能有着广泛的联系，如细胞间的黏附，自我与非自我的识别，分子运输与清除，受体激活，细胞的内吞作用等［2］。在肿瘤生物学中同样对疾病表型和糖基化改变之间的相关性做了大量研究。在很多情况下，在正常细胞转变为肿瘤细胞的过程中，一种或多种糖基转移酶活性的改变与糖基化密切相关。实验显示慢性淋巴细胞白血病（CLL）B细胞表面低水平的BCR表达，与μ和CD79a链的糖基化和折叠损伤有关［3］。

　　多肽：N乙酰氨基半乳糖转移酶催化O聚糖合成的第一步是，将UDPGalNAc上的GalNAc转移至蛋白质多肽链上特定序列中的Thr和Ser的羟基上而合成GalNAcαOSer／Thr多肽。β半乳糖基转移酶家族是糖基转移酶的一个家族，其β3GalT活性在动物广泛存在，用以形成半乳糖Gal和氨基己糖Hex(NAc)之间的 α或β连接。ppGalNAcT2和β3GalT7作为O糖基化的关键酶，参与蛋白质转录后糖基化修饰，其表达异常可造成细胞表面某些糖蛋白出现缺陷，从而出现某些病理症状。

　　本研究中我们检测到肝癌细胞株SMMC7721中ppGalNAcT2和β3GalT7表达较低或未表达，加入壳聚糖后其表达变化并不明显。而在加入壳聚糖之后，肺癌细胞株A549中ppGalNAcT2和β3GalT7的mRNA的表达均降低，且壳聚糖的浓度越高，对ppGalNAcT2和β3GalT7抑制作用越明显。说明壳聚糖具有抑制糖基转移酶的作用，从而抑制细胞表面糖基化，为肿瘤的预防和治疗提供新的方案。

　　我们的实验结果还显示，肺癌细胞株A549较高程度地表达ppGalNAcT2和β3GalT7，推测这两种糖基转移酶参与了肺癌细胞的分化，与细胞表面糖链结构的改变密切相关。加入壳聚糖后，ppGalNAcT2和β3GalT7的mRNA表达量降低，说明壳聚糖通过某种途径抑制了ppGalNAcT2和β3GalT7的表达。由于肿瘤发生中许多糖基转移酶的表达水平或活性都发生改变，从而影响细胞的周期调控和细胞的增殖能力，因此壳聚糖在肿瘤治疗上具有重要的应用价值。同时，糖基转移酶只与极少数的糖相互作用，自然界的小分子是许多天然药物的基础，而许多天然小分子活性会因附加其上的糖分子而改变。经过基因工程的改造，糖基转移酶能够用更多种类的糖基来修饰小分子［4］。基于这一技术，可以开发利用壳聚糖类药物，从而有助于发现新的治疗方法和多糖类药物。

参考文献

［1］ Berrada M， Serreqi A， Dabbarh F，et al.A novel nontoxic camptothecin formulation for cancer chemotherapy［J］.Biomaterials，2005，26（14）: 2115-2120

［2］ Ohtsubo K， Marth JD.Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease［J］.Cell，2006， 126(5): 855-867.

［3］ Vuillier F，Dumas G， Magnac C， et al.Lower levels of surface Bcellreceptor expression in chronic lymphocytic leukemia are associated with glycosylation and folding defects of the mu and CD79a chains［J］.Blood， 2005， 105(7): 2933-2940.

［4］ Williams GJ， Zhang C， Thorson JS.Expanding the promiscuity of a naturalproduct glycosyltransferase by directed evolution［J］.Nat Chem Biol，2007，3(10):604-605.