作者：彭其才， 许成芳， 滕奔琦， 侯红瑛
【摘要】 【目的】 探讨乙型肝炎病毒携带产妇血清HBV DNA含量对乳汁和新生儿血清中HBV DNA含量的影响，以指导孕期处理和母乳喂养。【方法】 选择乙型肝炎病毒携带产妇145例，采用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术对产妇血清、母乳和新生儿血清HBV DNA进行检测，并将产妇血清HBV DNA浓度分3级，分析产妇血清不同HBV DNA浓度级对乳汁及新生儿血清HBV DNA浓度的影响。【结果】 血清HBV DNA &< 500 copies/mL的产妇74例，乳汁中检出HBV DNA阳性为零，新生儿血清HBV DNA阳性1例;血清HBV DNA浓度为500 ～ 1.0 × 106 copies/mL产妇30例，乳汁中检出HBV DNA阳性为3例，新生儿血清HBV DNA阳性1例;血清HBV DNA浓度为≥1.0 × 106 copies /mL产妇41例，乳汁中检出HBV DNA阳性为36例，阳性率为87.8%，新生儿血清HBV DNA阳性仅3例。【结论】 产妇血清中HBV DNA≥1.0 × 106 copies/mL时， 乳汁中HBV DNA阳性率大幅度增加， 而当产妇血清HBV DNA浓度小于1.0 × 106 copies/mL， 乳汁中HBV DNA检出率极低。产妇血清HBV DNA浓度对宫内感染影响不大。
【关键词】 HBV DNA; 母婴传播; 母乳喂养; 荧光定量聚合酶链反应
Abstract： 【Objective】 To investigate the effect of maternal HBV?鄄DNA concentration on that of the breast milk of postpartum and neonatus with chronic HBV infection. So as to guide the treatment during pregnancy and breast feeding. 【Methods】 HBV DNA levels in serum， breast milk， and neonatus serum were detected by fluorescent quantitative polymerase chain reaction in 145 postpartum women with chronic HBV infection. Serum HBV DNA was graded into three levels. The effect of different grade of maternal serum HBV DNA on the breast milk and neonate was analyzed. 【Result】 Seventy-four cases of maternal serum HBV DNA quantity were &< 500 copies/mL， two of their breast milk HBV-DNA quantity were positive， one neonatal serum HBVDNA quantity was positive. Thirity cases of maternal serum HBV DNA quantity ranged of 500 ～ 1.0 × 106 copies/mL， 3 cases showed positive in breast milk， one neonatal serum HBV-DNA quantity showed positive. Forty-one cases of maternal serum HBV DNA quantity were &> 1.0 × 106 copies/mL， the HBV DNA positive rate in breast milk reached to 87.8% (36 cases)， only three cases neonatus showed positive in there serum HBV DNA quantity. 【Conclusions】 When maternal serum HBV DNA quantity goes beyond &> 1.0 × 106 copies/mL， the HBV DNA positive rate in breast milk increases sharply， when serum HBV DNA quantity goes below 1.0 × 106 copies/mL， the HBV DNA positive rate in breast milk is very low. Maternal serum HBV DNA concentration has little effect on intrauterine infection.
我国是乙型肝炎病毒(HBV)感染高发区，陈志英等[1]调查报道产妇HBV感染度高达23.51%。如何降低HBV感染率，阻断HBV的母婴传播是研究重点。目前对于乙肝携带者妊娠后应用乙肝免疫球蛋白阻断HBV宫内感染的效果[2-4]和产后母乳喂养会否传染HBV仍存在争议[5-6]。乙肝病毒DNA是判断传染性最为客观的指标[7]。本文用荧光定量PCR技术检测乙型肝炎病毒携带产妇血清、乳汁和新生儿血清中HBV DNA含量，分析产妇血清不同HBV DNA浓度对乳汁和新生儿血清HBV DNA浓度的影响，为孕期处理和产后母乳喂养提供指导依据。
1 材料与方法
1.1 检测对象
选择2009年1月至2009年12月间在我院产科分娩的乙型病毒性肝炎病毒携带产妇145例，其平均年龄28.8岁，最大40岁，最小21岁。
1.2 标本采集方式
血清：产妇空腹静脉采血2 mL、新生儿出生后24 h内乙肝被动-主动免疫前股静脉采血2 mL，均在2 h内分离血清备用。乳汁：清洗乳房后，挤乳汁0.5 ～ 1.0 mL于消毒试管内立即送检。
1.3 HBV DNA荧光定量PCR检测
试剂盒由中山大学达安基因诊断中心提供，荧光PCR扩增仪、ASAP专用软件由美国Biotronics公司提供，并严格按照KWOK 等提出的防止PCR污染措施实施。(1)标本处理：血清用水平离心机(EPPENDORF 5417R， r = 6 cm) 1 500 r/min离心5 min，吸取上层血清备用;乳汁用水平离心机5 000 r/min离心10 min，弃上层脂肪，取中层乳清备检。(2)HBV DNA提取(血清和乳汁标本处理同)：①取100 μL血清加入等量DNA浓缩液，用振荡器振荡混匀5 s;②12 000 r/min离心10 min;③去上清，沉淀中加入20 μL DNA提取液，振荡器剧烈振荡混匀5 ～ 10 s，瞬时离心数秒，100 ℃恒温处理(10 ± 1)min;④12 000 r/min离心5 min，备用;(3)PCR扩增：①加样——取PCR反应管若干，分别加入处理后的样品上清液2 μL，8 000 r/min离心数秒，放入仪器样品槽;②编辑——按对应顺序设置阴性质控品、阳性定量参考品以及未知标本，并在Name栏中设置样品名称。选中所有设置样品孔，点击工具栏中P键，选择PR1 Primer1后关闭窗口。打开instrument窗口，按药盒要求设置循环条件，保存文件，运行;③结果分析——反应结束后保存检测数据文件，在Analysis菜单下选择Analyze自动分析结果;④到Tray窗口，记录未知标本数值(C)。“C”表示样品的浓度或含量;标本HBV DNA浓度≥50O copies/mL为阳性[8]。
1.4 数据处理
采用EXCEL内统计软件进行数据处理，计量资料用t检验，计数资料用卡方检验。当P &< 0.05表示差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 乙肝携带者产妇血清HBV DNA情况
血清HBV DNA &< 500 copies/mL者(阴性) 74例，占51%;血清HBV DNA浓度为500 ～ 1.0 × 106 copies/mL者30例，占20.7%%;血清HBV DNA浓度为≥1.0 × 106 copies/mL者41例，占28.3%。
2.2 乙肝携带者产妇乳汁HBV DNA情况
乳汁HBV DNA &< 500 copies/mL者(阴性)106例占73.1%，≥500 copies/mL者(阳性) 39例占26.9%。①血清HBV DNA &< 500 copies/mL的产妇74例，乳汁中检出HBV DNA阳性为零;②血清HBV DNA浓度为500 ～ 1.0 × 106 copies/mL产妇30例，乳汁中检出HBV DNA阳性为3例，阳性率10%;③血清HBVDNA浓度为≥1.0 × 106 copies/mL产妇41例，乳汁中检出HBV DNA阳性为36例，阳性率为87.8%。①和②比较：0.05 &> P &> 0.01，差异有统计意义;①和③、②和③比较P值均 &< 0.01，差异有显著意义。说明1.0 × 106 copies/mL可能是一个界值浓度，产妇血清HBV DNA浓度 &< 界值浓度1.0 × 106 copies/mL时，乳汁中HBV DNA阳性率低，当≥界值浓度1.0 × 106 copies/mL时， 乳汁中HBV DNA阳性率大幅度增加。
2.3 乙肝携带者产妇分娩的新生儿血清HBV DNA情况
表1显示：新生儿血清HBV DNA &< 500 copies/mL者(阴性) 140例占96.6%，≥500 copies/mL者(阳性) 5例占3.4%。①血清HBV DNA &< 500 copies/mL的产妇74例，新生儿血清HBV DNA阳性1例，阳性率1.4%;②血清HBV DNA浓度为500 ～ 1.0 × 106 copies/mL产妇30例，新生儿血清HBV DNA阳性1例，阳性率3.3%;③血清HBV DNA浓度为≥1.0×106 copies/mL产妇41例，新生儿血清HBV DNA阳性仅3例，阳性率为7.3%。①和②、①和③、②和③比较P值均 &> 0.05，差异没有统计学意义，表明胎儿宫内感染与孕妇血清中HBV DNA浓度关系不大。
3 讨 论
3.1 关于HBV携带者的母乳喂养问题
2005年我国首发了慢性乙型肝炎防治指南，在母婴垂直传播的预防中明确提出新生儿在出生12 h内注射HBIG和乙型肝炎疫苗，可接受HBsAg阳性乳汁[5]。但也有持不同观点，Hill等[6]认为乳汁中HBV复制标志物HBsAg、HBeAg和HBV DNA是具有传染性的直接指标不宜哺乳。
乙型肝炎病毒核酸基因(HBV DNA)是乙肝病毒的遗传物质基础，是反映HBV复制及传染性的直接指标。从本研究结果看，乙肝携带者产妇血清HBV DNA有51%阴性，49%阳性。在血清HBV DNA阴性产妇中，其乳汁中HBV DNA全部阴性;在血清HBV DNA的阳性的产妇中， 当血清HBV DNA浓度小于1.0 × 106 copies/mL时，乳汁中HBV DNA阳性率低，仅10%， 当血清 HBV DNA浓度达到或超过界面浓度1.0 × 106 copies/mL时，乳汁中HBVDNA阳性率高达87.8%，阳性率大幅度增加。说明产妇血清HBV DNA分泌到乳汁中可能具有浓度界值(TRAM等[9]将1.0 × 106 copies/mL作为低、高危的分界线)，当产妇血清HBVDNA达到或超过界值浓度时，乳汁中HBV DNA阳性率大幅显著增加，而小于这个界值浓度时乳汁中HBV DNA阳性率低，但仍比血清HBV DNA阴性产妇高，差异有统计意义。
产妇血清HBV DNA分泌到乳汁存在界值浓度的发现，对指导乙肝病毒携带者母乳喂养，预防HBV母婴传播具有重要的意义。纯母乳喂养是目前被视为婴儿最理想的天然食品，母乳中含有HBV DNA就有可能诱发乙肝病毒感染[7]。根据我们的检测结果，乳汁HBV DNA阳性的产妇，不宜哺乳喂养应改为人工喂养;当产妇血清和乳汁HBV DNA均阴性时可以放心实行母乳喂养;当产妇血清HBV DNA阳性浓度在500 ～ 1.0 × 106 copies/mL时，检测乳汁HBV DNA浓度确定可否母乳喂养;当产妇血清HBV DNA浓度达到或超过界值浓度1.0 × 106 copies/mL时，HBV DNA容易大量进入乳汁，建议也不宜母乳喂养，若一定要母乳喂养，必需定期检测乳汁HBV DNA含量，或应用乙肝免疫球蛋白(HBIG)将产妇血清HBV DNA浓度降低至界值浓度以下，以减少HBV母婴传播的危险[7]。
3.2 关于HBV携带者的胎儿宫内传染
检测HBV DNA也是诊断宫内感染及HBV传染性最为客观的指标[2，7]。我们的研究结果发现，145例乙肝携带者产妇中，血清HBV DNA阳性率49%，新生儿血清HBV DNA阳性率为3.4%，与潘文涛等[10]报道相近。产妇血清中HBV DNA浓度对胎儿宫内感染率影响不大(P &> 0.05)，与韩忠厚等[2]研究结论相似。HBsAg阳性产妇中49%具传染性，而宫内感染率才3.4%，说明母体内HBV宫内传播受到阻隔，而这个阻隔因素，主要是胎盘的屏障作用。
综上所述，产妇血清中HBV DNA分泌到乳汁有浓度界值而对胎儿宫内感染却不表现浓度界值，其机理值得进一步研究。但界值浓度的发现为HBV感染产妇选择是否母乳喂养提供了指导依据，同时，产妇血清中HBV DNA浓度对胎儿宫内感染率影响不大提示孕期抗病毒治疗对预防宫内感染意义不大。
参考文献
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潘文涛，尹玉竹，谌小卫，等. HBV宫内感染预测指标的探讨 [J]. 中山大学学报：医学科学版，2010，31(1)：110-113.