作者：王哲，孙宏伟，王浩，柳春，于化新，王德山
【摘要】 目的 观察肺气虚证模型大鼠肾组织水通道蛋白2(AQP2)表达的变化，为机体水液代谢过程中肺肾相关理论提供依据。方法 20只大鼠随机分为模型组和对照组，用免疫组化、Western blot、RT-PCR方法测定肾组织AQP2蛋白及mRNA表达。结果 肺气虚证模型组肾组织AQP2表达增加，AQP2 mRNA表达增高，与正常对照组比较，差异有统计学意义(P＞0.01)。结论 肺气虚证模型大鼠肾组织AQP2表达增强，提示肺主“通调水道”功能可能与影响肾小管AQP2表达有关。
【关键词】 肺气虚证；肾组织；水通道蛋白2；大鼠
Abstract：Objective To observe the effects of kidney aquaporin-2 (AQP2) expression in Lung-Qi deficiency model rats and provide experimental evidence for the traditional Chinese medical theory that the kidney is related with the lung in charge of regulating the water passage. Method Twenty healthy rats were pided into the model group and the control group. The method of immunohistochemistry and Western blot was used to determine the expression of AQP2 in kidney. RT-PCR was applied to analyze the expression of AQP2 mRNA in lung and kidney tissues. Result The expression of AQP2 and AQP2 mRNA in kidney in model group was higher than in the control group. Conclusion The expression of AQP2 in kidney was higher in Lung-Qi deficiency model rats. One of the substance basis of “lung in charge of regulating the water passage” may be related to the change of AQP2 expression in the kidney tissues.
Key words：Lung-Qi deficiency；kidney tissues；aquaporin-2；rat
中医学认为“肾主水，肺为水之上源”，肺与肾两脏在维持体内水液代谢平衡过程中有着密切关系。水通道蛋白(AQP)是多种细胞膜上存在的特异性转运水分子的蛋白通道，其中AQP2主要分布在肾脏集合管的主细胞上，是转运水分子的关键蛋白。笔者利用分子生物学手段观察了肺气虚证模型大鼠肾AQP2表达的变化，以期为体液代谢过程中肺肾相关理论提供依据。
1 材料与方法
1.1 动物及分组
健康Wistar大鼠20只，辽宁中医药大学实验动物中心提供，雌雄不拘，重量为(225±25)g。动物许可证号：SCXK(辽) 2004-0018。随机分为对照组和模型组，每组10只。
1.2 主要试剂及药物
脂多糖(LPS)由美国Sigma公司提供，AQP2抗体由武汉博士德公司提供。
1.3 造模
模型组：
参考文献
[1]方法，于模型复制的第1、14日用10%水合氯醛腹腔麻醉后，行气管内注入LPS 200 μg/200 μL，消毒缝合皮肤、庆大霉素局部抗炎。分别于术后第2～13日、15～28 日置于1 m3烟室中，香烟(焦油量为12 mg，烟碱量为1.1 mg)烟熏，每日30 min；自由进食水。对照组：将每只大鼠于第1、14日气管内注入0.9%氯化钠注射液200 μL；于第2～13日、15～28日置于无烟熏同样环境，余法同模型组。1.4 一般状况
观察2组大鼠活动量、毛发、食量、呼吸、咳嗽、大便等情况，以反映气虚的有无和程度的轻重。
1.5 大鼠尿量、尿比重的测定
取大鼠代谢笼在动物造模第28 日开始留取大鼠24 h尿液，用量筒测量24 h尿量；采用折射计法测定尿比重。
1.6 水通道蛋白的表达
免疫组化方法：石蜡切片，按试剂盒操作。以出现清晰棕褐色颗粒为阳性。使用BI2000医学图像分析系统，对采集的图像测定阳性反应物的灰度，每例动物随机取3～4张切片，且各组所选部位相同。
Western blot法：取肾组织，按组织净重加入相应体积的裂解液(裂解液＝1∶10)，pH为7.5，将样品剪碎后匀浆、离心，上清即为总蛋白。兔抗鼠AQP2一抗(1∶500)；O-dianidine，β- naphthyl acid phosphate显色；扫描仪扫描NC膜，分析结果。
1.7 水通道蛋白2 mRNA的表达
采用RT-PCR法。AQP2上游引物：5'GTAGTTGTAGAGGAGGGA GCC3'；下游引物：5'GGGGACCTGGCTGGCTGTCAATGC3'。β-actin上游引物：5'-GCCAACCGTGAAAAGATG-3'；下游引物：5'-CCAGGAT AGAGCCACCAAT-3'。琼脂糖凝胶电泳、EB染色，采用电泳凝胶成像系统进行扫描成像。
1.8 统计学方法
用SPSS10.0软件统计分析，数据均采用x±s表示，组间比较用t检验。
2 结果
2.1 一般状态的变化
对照组大鼠活泼好动，毛发光泽，饮食自如，体重逐渐增加，呼吸平稳，口鼻清洁红润。模型组大鼠先后出现咳嗽、气急、喘鸣、鼻部潮湿微红、精神萎靡、行动迟缓、蜷伏不动、毛失光泽并有脱落等症状，同时食量逐渐减少，大便变软变稀。
2.2 大鼠尿量、尿比重的变化
(见表1)表1 2组大鼠尿量、尿比重的变化(略)注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01(下同)
2.3 肾组织水通道蛋白2 mRNA表达的变化
本实验选用β-actin作为内参，采用RT-PCR方法检测肾组织AQP2 mRNA的表达。结果见表2、图1。 表2 肾组织AQP2和β-actin RT-PCR凝胶电泳分析结果(略)
2.4 肾组织水通道蛋白2表达的变化
（见图2、表3、表4）表3 肾组织AQP2阳性蛋白表达测定(略)表4 肾组织AQP2 Western blot凝胶电泳分析(略)
3 讨论
AQP2是1993年被克隆确认的AQPs家族中的一种，位于肾集合管主细胞管腔侧和靠近管腔侧的囊泡内，是调节肾脏集合管对水通透性的主要AQPs，在肾脏尿浓缩机制中起重要作用，约1O%肾小球滤过液流经集合管时在AQP2参与下被重吸收。AQP2受加压素调节，尚有其他因素参与其调节[2]。
动物造模一般状态表明肺气虚证模型组大鼠的症状符合肺气虚的表现，说明肺气虚证模型复制是成功的。肺通调水道的功能是通过肺气的宣发和肃降完成的，肺不断将上焦水液下输至肾和膀胱，以调节体内的水液代谢，故又有“肺为水之上源”之说。如果肺失宣降，行水无力，水道不通，水液输布排泄障碍，使多余的水液不能排出而停聚于体内，则见咳喘、咳痰、浮肿、尿少等症。而尿生成过程包括肾小球的滤过、肾小管与集合管的重吸收、肾小管与集合管的分泌等3个环节，尿比重升高可能由肾小球的滤过减少、肾小管与集合管的重吸收增加引起。
有研究表明，伴有水钠潴留的许多病理过程，如充血性心衰、肾病综合征以及肝硬化等引起水潴留机制部分可能与肾组织AQP2的调节异常有关。在许氏等[3]充血性心衰大鼠模型肾组织AQP2表达的实验中显示，充血性心衰在AVP增加的同时有肾组织AQP2基因mRNA和蛋白质表达上调。朱氏等[4]研究显示，心衰程度较重的大鼠肾脏皮质AQP2 mRNA表达显著高于对照组。
Frokiaer等[5]观察双侧输尿管梗阻的大鼠发现，去除梗阻后的尿浓缩功能障碍主要与AQP2表达减少有关。而本实验利用免疫组化、RT-PCR、Western blot杂交技术，表明肺气虚证模型大鼠肾组织AQP2蛋白表达增加，AQP2 mRNA表达增高，使肾脏集合管对水的重吸收增加，尿液被浓缩，尿液生成减少，所以引起钠水潴留，机体出现水液代谢障碍。上述结果表明，肺气虚时由于“肺失宣降”，“通调水道”功能失职，能够累及于肾脏“主水液”的功能。可以认为，肺肾相关的内涵之一可能是肺气虚时肾组织AQP2的表达发生明显的改变。这一实验结果为肺肾两脏在水液代谢过程中的相互关联性提供了实验依据。
参考文献
[1] 李泽庚，彭 波，张杰根，等.肺气虚证模型大鼠的建立[J].北京中医， 2005，24(1)：53－55.
[2] 王 哲，太史春.实验性肺气虚对大鼠肺、肾组织AQP2表达的影响[J].中华中医药学刊，2007，25(9)：1846－1848.
[3] 许顶立，任 昊.充血性心衰水潴留的机制——Aquaporin2水通道蛋白的作用[J].生理科学进展，2000，31(2)：150－152．
[4] 朱彤莹.充血性心力衰竭时肾脏水通道蛋白mRNA表达的改变及意义[J].中华肾脏病杂志，2002，18(6)：438－441.
[5] Frokiaer J， Marples D， Knepper MA， et al. Bilateral ureteral obstruction downregulates expression of vasopressin-sensitive AQP2 water channel in rat kidney[J]. Am J Physiol，1996，270：F657－F668.