第一篇 文献综述
第一章 中东呼吸综合征与中东呼吸综合征冠状病毒
1.1 中东呼吸综合征流行病学与临床症状
中东呼吸综合征（MERS）是继 2003 年非典（SARS）肆虐以来的又一由冠状病毒感染所致的呼吸道传染病。该病的病原体——中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）于 2012 年在沙特阿拉伯的一位死于严重的肺炎与多器官衰竭的病人身上被首次分离得到[5]。在同年的 4 月，一些更多的 MERS 感染病例被相继报道[6]。从首例 MERS 病例被报道到 2017 年 5 月 27 号，WHO 共收到来自 27个国家的 1952 份实验室确诊的人类感染 MERS-CoV 病例，其中 690 份死亡病例，经统计，其死亡率在 35%[1]。通常，人类冠状病毒的感染不会产生严重的病症，而 2003 年 SARS-CoV 所来带的严重疫情却打破了这一观点[7]。
MERS-CoV 主要存在于沙特阿拉伯并且持续在阿拉伯半岛循环，该国报告了全球大多数（>85%）的 MERS 病例。中东以外地区也有若干 MERS 病例报告，其中绝大多数病例被认为是在中东获得感染，而后输出到其它地区[8]。当前的流行病学研究表明，病毒由单峰骆驼传播至人类的原因可能是接触到感染骆驼的鼻液或其他分泌液、粪便，或者食用了生的骆驼制品（比如生的骆驼奶）[9]。与 SARS的高传染性不同，MERS 的人际间传播能力有限。若非发生密切接触（例如在未采取有效个人防护的情况下照顾 MERS 患者），MERS 病毒不会轻易发生人际传播。而 MERS-CoV 在人际间的传播多是由于接触到了 MERS 病人呼吸或咳嗽所产生的空气飞沫。尤其是当所处环境更有利于气溶胶的生成、所处环境的通风条件差，或者相关人员的自我防护意识差时，这种人传人的风险更大[10]。另外，由于 MERS-CoV 会存在于 MERS 病人所在病房环境的一些表面区域，因此接触到这些地方也可能会导致感染。迄今为止，尚未有 MERS-CoV 造成社区内持续传播的报告[11, 12]。虽然早期的研究指出 MERS 只呈现有限的人传人经过，不过2015 年发生在韩国的 MERS 疫情中，首次出现了第四代感染病例。研究人员认为，这次在在韩国发生的 MERS 疫情中，三位“超级传播者”造成了将近 75%的感染病例[13]。经 WHO 统计，感染 MERS 的病人，其平均年龄在 52 岁，其中将近三分之二为男性。令人不解的是，儿童很少感染 MERS[14]。
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1.2 中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）
冠状病毒的命名来源于其在电镜下所呈现的日冕或者皇冠样的形状。这些由病毒外膜表面向外辅散的结构来自于以三聚体形式存在的冠状病毒 S 蛋白。MERS-CoV 是继 HCoV-OC43、HCoV-HKU1、HCoV-229E、HCoV-NL63 与SARS-CoV 之后被发现的第六种，同时也是第一个β冠状病毒属 C 亚群的能够感染人类的冠状病毒[21]。
与其他冠状病毒相似，MERS-CoV 有囊膜包裹，其基因组为单股正链，长度大约为 30kb。该病毒基因组由 10 个开放阅读框（ORF）构成，共编码包括刺突蛋白（spike S）、包膜蛋白（envelope E）、核蛋白（nucleocapsid N）、基质蛋白（membrane M）在内的 4 种主要结构蛋白与 16 种非结构蛋白[22]。在MERS-CoV 的结构蛋白中，S 蛋白是刺激机体产生中和抗体的主要抗原蛋白.MERS-CoV 的 S 蛋白为 I 型融合蛋白，包含了 N 端的受体结合部 S1 亚单位与 C端的膜融合部 S2 亚单位。S1 与 S2 亚单位间存在蛋白酶裂解位点，只有在 S1 与S2 亚单位在蛋白酶作用下被裂解开后，S 蛋白才获得了膜融合活性。S1 亚单位中包含了分列两端的 C-domain 与 N-domain。C-domain 中包含了受体结合域（RBD）[23]。RBD 的区域定位存在一定的争议。根据世界范围内的不同实验室所提供的的数据，RBD 的长度在 200-300 个氨基酸大小，而其在 S1 中的定位则各异: 358 to 588aa, 367 to 588aa, 367 to 606aa, 377 to 588aa, or 377 to 662 aa(29–36)。由病毒中和试验与蛋白结构分析实验得到的结果来看，377-588aa 这一 RBD的定位是最有可能的[24]。杆状形状的 S2 亚单位具有膜融合活性，其包含有融合肽、七肽重复序列结构域（heptad repeat, HR）HR1 与 HR2、跨膜区结构域、胞内区结构域[25, 26]。MERS-CoV 基因组所编码的各种非结构蛋白将参与到病毒的复制过程。这其中，有一种具有校对功能与外切酶活性的 RNA 酶，它可以在病毒核酸扩增的过程中调解复制的精准度[21]。
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第二章 马抗血清制品概述
2.1 抗血清发展历史
1877 年，Fornara 用蟾蜍皮肤分泌物对狗进行多次免疫后发现其可以抵抗蟾蜍毒素的攻击。这是官方记载的首次通过多次免疫接种对动物进行保护的实验[107]。1887 年，Sewall 进行了相似的实验，他对鸽子进行了多次逐渐增加的小剂量响尾蛇毒液的接种，之后发现在多达 7 次的大于致死剂量的响尾蛇毒液的攻击下，鸽子仍能存活，且没有任何副反应发生[108]。
1890 年，Emil von Behring 与 Shibasuro Kitasato 首次发表了一篇关于破伤风抗血清的文章。随后，Emil von Behring 对于白喉抗血清的研究使他获得了 1901年的诺贝尔医学与生理学奖[109]。由此，在之后的 120 年间，科学家在不断对抗血清被动疗法进行深入的研究[110, 111]。1892 年，Kaufmann 成功地重复了 Sewall在 1887 年的实验，而这次采用的动物是狗，所使用的免疫原为蝰蛇毒液[112]。1894年，Césaire Phisalix 与 Gabriel Bertrand 证明，采用热灭活的蝰蛇毒素免疫豚鼠，免疫后采集的血清具有对天然蝰蛇毒素的中和活性[113]。采用类似的方法，Albert Calmette 制备了能够中和眼镜蛇毒素的抗血清[110]。这些早期的实验为以生产抗血清或者保护免疫动物为目的动物免疫程序的制定打下了基础。此后不久，通过对毒素暴露动物注射抗血清以进行治疗的被动血清疗法便得到了一系列的应用。1895 年，Léon Charles Albert Calmette 通过免疫马匹制备了抗印度眼镜蛇毒的抗血清制品，并进行出售[114]。1924 年，Gaston Ramon 通过甲醛脱毒法成功制备了类毒素，这大大推动了抗血清疗法的发展[115]。
20 世纪 30 年代，世界步入了抗生素的时代。盘尼西林（青霉素）的发现使得人们在治疗传染性疾病时有了新的选择[116]。抗生素在生产程序上比抗血清更简单，在疾病的治疗效果上更明显，同时对病人的毒副作用更小。此外，抗血清产品的质量与批间稳定性都严重依赖来源动物的品质，而工业化的生产标准使得抗生素在产品质量与批间稳定性上要远远高于同时期的抗血清制品。另外，也是更重要的一点，许多新的广谱抗生素的发现，使得其在使用时可以不用对病人的感染情况进行精细的诊断；而与此相反，在使用抗血清制品进行治疗时，需要对病人的病因进行明确的诊断。综上，抗生素的种种优势对抗血清制品产业造成了严重冲击，并最终使得动物高免抗血清疗法的使用被限制在一些暂无其他治疗方法的传染病或毒素中毒上[117-119]，如一些烈性疾病或者毒素中毒，如狂犬病、破伤风、白喉或者各种蛇毒、蝎毒中毒等等。今日，面对一些新发、突发、再发烈性传染病，如埃博拉、西尼罗河热、SARS、H7N9 禽流感、中东呼吸综合征等，马抗血清制品依然是可行的候选治疗药物[96, 120-123]。
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2.2 抗血清的制备
2.2.1 免疫原的制备
制备抗血清的第一步是免疫动物所需免疫原的获得。这些免疫原可以是从有毒动物体内分离得到的天然毒素（如各种蛇毒、蝎毒）、致病微生物分泌的天然毒素（如白喉毒素、破伤风毒素等）、一些病原体本身（如灭活的狂犬病病毒），也可以是体外合成的各种病原体的亚单位蛋白。很重要的一点是，无论免疫原的类型如何，其免疫原性的保持是十分重要的。
早期，大多数的抗血清生产商对马匹直接免疫天然的不经过灭活的各种生物毒素（如蛇毒、蝎毒等），并且免疫的同时使用完全或不完全弗氏佐剂，以达到对机体的最大刺激效果。然而在一些情况下，天然毒素的巨大毒性对免疫马匹的健康也造成了巨大的威胁。随后的一些研究表明，采用部分程度灭活的天然毒素对马匹进行免疫，同样足够刺激机体产生中和抗体，并且对马匹的健康也不会造成威胁。此外，通过外源表达重组毒素蛋白作为免疫原也是一种可行的方法，但其与天然毒素的区别还有待研究[124]。
2.2.2 动物的选择
通常情况下，马是最常用的动物，因为其具血量大的明显优势。从 1L 的马血液中可以制得 100ml 的抗血清制品。对马匹的采血可以每 4 周进行一次，并且可以持续 6 年的时间[125]。然而，马也有一些明显的缺点，马的抗体分为许多亚类，其中的一种高度糖基化的 IgG(T)虽然具有很高的病原中和活性，但是对于被给予治疗的动物来说，尤其是人类，IgG(T)具有强烈的免疫原性[126]。
在抗血清发展的历史上，绵羊、山羊、猪、驴、兔子也曾经作为过生产抗血清的供体动物。绵羊的抗体中没有 IgG(T),因此比马抗血清安全性更高，但是绵羊因为血量较少，所以抗血清的产量不高。而家兔在澳大利亚曾被用来当作生产抗漏斗蛛毒液抗血清 F(ab’)2的动物。近些年，研究人员发现用蛇毒免疫母鸡，可以收获具有蛇毒中和活性的卵黄囊抗体[127, 128]。
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第三章 免疫亲和层析技术制备马抗 MERS-CoV 特异性 F(ab’)2 ............... 42
3.1 材料与方法 ...................................... 43
3.2 结果 ............................... 47
3.3 讨论 ................................ 53
3.4 小结 ................................. 55
第二篇 研究内容
第一章 层析技术制备马抗 MERS-CoV 免疫球蛋白 F(ab’)2
用于被动免疫治疗的抗血清制品具有悠久的历史，这一最经济有效的手段之一至今在某些中毒与疾病（如蛇毒感染、蝎毒感染、白喉、破伤风、狂犬病、坏疽等）的治疗上仍发挥重要作用。抗血清制品在使用中所带来的的最大问题是异源蛋白导致的过敏反应，而这其中，抗体的 Fc 片段或碎片化的 Fc 片段对过敏发应的发生贡献最大。目前，我国 2015 版中国药典中记录的 10 种（不区分剂型）人用马属动物抗血清制品，均通过酶切消化盐析的方法除去 Fc 片段并制备纯化F(ab’)2。以盐析为基础的纯化方法的缺点在于制品的产量低、纯度差、并且较长的生产周期还可能带来细菌污染的风险。虽然不断有研究对马免疫球蛋白制品的生产工艺进行改良，但整体纯化思路仍围绕着盐析、沉淀、离心等传统技术开展。即便是WHO所建议的抗血清制备工艺也没有脱离盐析离心的制备纯化思路[136]。为提高产品的纯度与质量，有必要改进传统生产方式，建立新的工艺。
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结论
1. 初步建立了基于全程层析技术的马源免疫球蛋白 F(ab’)2的制备纯化方法。通过工艺优化，制备得到了高纯度的马抗 MERS-CoV 免疫球蛋白 F(ab’)2。在相同给药浓度下，F(ab’)2在 MERS 假病毒中和活性上要高于 IgG。
2. 初步建立了基于免疫亲和层析技术的马抗 MERS-CoV 特异性 F(ab’)2的制备纯化方法。以原核表达的 MERS-CoV S 蛋白受体结合域（S-RBD）为抗原偶联蛋白所制备的免疫亲和柱可以从高免血清中提取得到高活性的抗 MERS-CoV 特异性抗体成分。
参考文献(略)