本文是一篇医学论文，笔者认为MIF可能以剂量依赖性模式促进关节囊成纤维细胞TGF-β1蛋白表达，与关节囊成纤维细胞CD74膜受体相结合，促进MAPK信号通路亚级联信号传导途径ERK、P38、JNK蛋白磷酸化；
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1主要实验仪器
医学论文怎么写
...........................
1.2实验方法
1.2.1原代关节囊成纤维细胞培养
1.2.1.1原代关节囊成纤维细胞培养方法
（1）4周龄雄性Sprague Dawley（SD）大鼠10只，购自于上海西普尔-必凯实验动物有限公司（许可证号SYXK（沪）2018-0026）。通过往大鼠腹腔内注射剂量为100mg/kg的戊巴比妥钠溶液，过量麻醉安乐死大鼠。大鼠安乐死后，将其全身浸泡于75%酒精中消毒10min。
（2）在超净台上，从大鼠双后肢股骨近端处快速离断，将大鼠膝关节周围肌肉、肌腱、筋膜等结构小心剥离，并取大鼠双膝关节后方关节囊，使用无菌PBS冲洗3遍。
（3）使用眼科剪将关节囊组织均匀剪碎，并将其转移至10cm培养皿中，加入适量 Ⅰ 型胶原酶（2.5mg/mL，不含血清的DMEM配制），37℃摇床消化2h。
（4）消化完成后，组织碎片通过使用高压灭菌过的200目筛网来过滤去除，过滤液转移至容量为15mL的EP管中，1500rpm离心5min。
（5）移液器吸取上清液弃掉，加入DMEM培养基洗涤2遍细胞沉淀，1500rpm离心5min。
（6）弃去上清，加入配置好的DMEM高糖培养基（含10% 胎牛血清及1% 青-链霉素溶液）重悬细胞沉淀，并将其转移至培养瓶中，轻轻的摇晃均匀。
（7）培养瓶放置于恒温37℃，含5% CO2的细胞培养箱中培养，每2天更换1次培养液，以除去未贴壁的细胞，细胞的生长状态通过倒置显微镜进行仔细观察。
（8）细胞增殖至瓶底80%-90%的面积时，移液器吸取旧培养液弃掉，加入无菌PBS清洗2遍后，加入1-2mL的0.25% EDTA胰蛋白酶，将培养瓶继续放置于恒温37℃，含5% CO2的细胞培养箱中消化3min。
（9）当细胞间距增大、皱缩变小、部分细胞悬浮的现象可以在显微镜中观察到后，加入DMEM完全培养基（体积为胰蛋白酶的2倍）终止消化。
（10）准备容量为15mL的离心管，吸取细胞悬液转移至其中，1500rpm离心5min，弃去上清后，用DMEM完全培养基重悬，并进一步按需要接种于培养皿中。成纤维细胞通过免疫细胞化学染色方法，波形蛋白阳性结果来鉴定，传代2-4代用于后续实验。
...........................
2实验结果
2.1不同浓度MIF对关节囊成纤维细胞活力的影响
为确定MIF无细胞毒性的安全浓度范围，本实验使用0、0.1、0.5和2.5μg/mL不同浓度MIF重组蛋白处理关节囊成纤维细胞，CCK-8法检测细胞活力变化。结果如图9所示，与0μg/mL相比0.1、0.5μg/mL的MIF重组蛋白对关节囊成纤维细胞活力没有显著影响（P>0.05），2.5μg/mL的MIF重组蛋白导致关节囊成纤维细胞活力显著增高（P<0.05），0-2.5μg/mL的MIF重组蛋白浓度范围不会导致关节囊成纤维细胞活力显著下降，表明该浓度范围适用于后续实验。
医学论文参考
..............................
2.2不同浓度MIF对关节囊成纤维细胞TGF-β1表达产生的影响
为了进一步探究MIF如何调节关节囊成纤维细胞TGF-β1表达，使用0、0.1、0.5和2.5μg/mL不同浓度的MIF重组蛋白处理关节囊成纤维细胞24h后，Real time PCR、Western Blot检测关节囊成纤维细胞TGF-β1表达水平变化。结果如图10所示，与0μg/mL相比，0.1、0.5和2.5μg/mL的MIF重组蛋白均可以显著诱导TGF-β1在mRNA（图10 A）和蛋白（图10 B）水平表达增加（P<0.05），且TGF-β1表达水平随MIF浓度的增加而不断增高。以上结果表明，MIF可能以剂量依赖性模式促进关节囊成纤维细胞TGF-β1表达。并在参考先前文献[76]及课题组预实验研究基础上，选择2μg/mL的MIF重组蛋白浓度用于后续实验干预。
为了进一步探究加入MIF特异性抑制剂4-IPP后是否阻断了MIF对关节囊成纤维细胞TGF-β1表达产生的影响，分别使用 2μg/mL MIF 重组蛋白、50μM MIF 特异性抑制剂 4-IPP、2μg/mL MIF 重组蛋白联合 50μM MIF 特异性抑制剂 4-IPP 处理关节囊成纤维细胞 24h。结果如图11所示，与Control组相比，4-IPP组TGF-β1 mRNA和蛋白表达无显著变化（P>0.05），MIF组TGF-β1 mRNA和蛋白表达水平均显著增加（P<0.05）。与MIF组相比，MIF＋4-IPP组TGF-β1 mRNA和蛋白表达水平又显著下降（P<0.05）。以上结果表明，MIF可能促进关节囊成纤维细胞TGF-β1表达，加入MIF特异性抑制剂4-IPP后可能阻断了MIF的作用。
..........................
3讨论 ........................... 42
3.1 MIF对关节囊成纤维细胞TGF-β1表达产生的可能影响 ........................ 42
3.2 MIF促进关节囊成纤维细胞TGF-β1表达可能依赖于CD74膜受体 ................. 42
3.3 MIF促进关节囊成纤维细胞TGF-β1表达的可能机制 ...................... 43
4 小结 ....................... 44
3讨论
3.1 MIF对关节囊成纤维细胞TGF-β1表达产生的可能影响
医学论文参考
MIF作为一种广泛分布的多功能促炎细胞因子，参与多种与炎症和纤维化相关疾病的病理生理学，通过诱导TGF-β1表达，促进疾病发生发展。Chen PF等[73]经动物实验研究表明，MIF可以显著诱导卵清蛋白致敏小鼠肺组织中TGF-β1表达，促进与气道重塑相关的气道上皮下胶原沉积，致使气道上皮发生结构和形态变化。使用MIF小分子拮抗剂抑制MIF表达后可以显著降低卵清蛋白致敏小鼠肺组织中TGF-β1 mRNA表达水平及支气管肺泡灌洗液上清液中的TGF-β1蛋白表达水平。Leung JC等[74]也经研究发现，MIF可以在体外培养的小鼠肾小球系膜细胞中以时间和剂量依赖性模式诱导TGF-β1在mRNA和蛋白质水平上表达增加。在模拟免疫球蛋白A肾病的小鼠模型中静脉输入MIF抗体后可以降低小鼠肾小球中的TGF-β1蛋白表达水平并改善小鼠的肾损伤情况。但是目前关于MIF是否能在关节囊成纤维细胞中诱导TGF-β1表达还未见报道。
为了探究MIF对关节囊成纤维细胞TGF-β1表达产生的可能影响，本研究在参考先前研究文献[75,76]和预实验的研究基础上，使用不同浓度（0、0.1、0.5、2.5μg/mL）的MIF重组蛋白处理关节囊成纤维细胞24h，发现关节囊成纤维细胞TGF-β1蛋白表达水平随MIF重组蛋白浓度的增加而不断升高。并且在进一步分别使用2μg/mL MIF重组蛋白、50μM MIF特异性抑制剂4-IPP、2μg/mL MIF重组蛋白联合50μM MIF特异性抑制剂4-IPP处理关节囊成纤维细胞24h后发现，与Control组相比，4-IPP组TGF-β1 mRNA和蛋白表达无显著变化，MIF组TGF-β1 mRNA和蛋白表达均显著增强，与MIF组相比，MIF＋4-IPP组TGF-β1 mRNA和蛋白表达水平均又显著下降。以上结果表明，MIF与关节囊成纤维细胞TGF-β1表达紧密相关，MIF可能以剂量依赖性模式促进关节囊成纤维细胞TGF-β1表达。
............................
全文总结
1、大鼠膝关节PTJC模型中MIF、TGF-β1表达增加。
2、MIF可能通过与关节囊成纤维细胞CD74膜受体相结合，激活MAPK信号通路中的ERK、P38亚级联信号传导途径，促进关节囊成纤维细胞TGF-β1表达，从而促进纤维化标志物α-SMA、COL Ⅰ 表达增加，促进关节囊纤维化，调控PTJC中的纤维化反应。
参考文献（略）