第一章 绪论
1.1 蛋白酪氨酸磷酸酶
蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPs）是一个由 107 个成员组成的蛋白质大家族，根据催化域的氨基酸序列不同，PTP 可以分为四个家族（I、II、III 和 IV 类），具有去除酪氨酸磷酸化功能[1]。蛋白酪氨酸激酶（PTKs）和蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPs）的动态平衡可保持细胞内正常的酪氨酸磷酸化水平，该调节的失衡会导致细胞的生长增殖、迁移、组织分化等，进而引起系列疾病，如糖尿病、白血病、癌症以及自身免疫症等 [2]。
目前已经报道了多种靶向 PTK 的小分子抑制剂，并且有些已应用于临床研究，但已发现的靶向 PTPs 的抑制剂仍然存在选择性差、生物利用度低、细胞通透性不佳等问题，所以 PTPs 作为抗肿瘤药物的潜在靶点，尚未确定通过调节PTPs 用于癌症治疗的有效策略 [3]。
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1.2. SHP1 和 SHP2 简介
SHP（含 Src 同源 2 域的蛋白酪氨酸磷酸酶）是非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶的一个小亚家族，具有去除酪氨酸磷酸化作用，由 SHP1（由 PTPN6 编码）和SHP2（由 PTPN11 编码）组成。SHP1 和 SHP2 在 PTP 域中共有 61％的氨基酸序列相似性和 75％的序列同一性。SHP1 和 SHP2 具有相似的结构域排列，包括一个 PTP 催化结构域，两个串联的 SH2 结构域（N-SH2 和 C-SH2）和一个带有两个酪氨酸磷酸化位点的 C 末端。尽管 SHP1 和 SHP2 中催化位点的氨基酸残基高度相同，但在催化位点附近的四个近端区域存在不同的残基。
在生物功能上，SHP1 和 SHP2 均是连接多个细胞内致癌信号通路（例如Jak / STAT、PI3K / AKT、RAS / Raf / MAPK 和 PD-1 / PD-L1 通路）的重要枢纽。SHP1 和 SHP2 的功能失调，均会导致癌症等重大疾病的发生，并且正在成为癌症治疗的重要靶标[4-5]。
在早期开发中已经报道了几种 SHP2 抑制剂。使用面向生物学的合成文库，发现呋喃衍生物 1（NAT6-297775）抑制 SHP2，IC50值为 2.47 μM（图 1-1）[6]。通过筛选组合文库[7]并使用基于结构的方法[8]，SHP2 抑制剂 2（SHP2 IC50 = 10 μM）和 3（SHP2 IC50 = 1.8 μM）被成功鉴定发现（图 1-1）。发现两者均也抑制 PTP1B 和 SHP1 的磷酸酶活性。最初发现另一种肉桂酸衍生物 4 和5 与类维生素 A 受体 γ（RARγ）结合，在包括 AML 在内的多种癌细胞系中诱导凋亡[9]。后续研究表明，4（SHP2 IC50 = 0.45 μM）对 SHP2 具有抑制活性，但未评估其选择性（图 1-1）[10]。4 包含一个 3-氯肉桂酸基团，其中肉桂酸中的β 碳可能充当迈克尔受体与蛋白质中的半胱氨酸反应[11]。SHP2 抑制剂 4 的作用模式仍有待确定。
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第二章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验试剂
实验所用所有试剂以及溶剂均通过商业途径购买，从国药基团化学试剂有限公司、上海毕得医药科技有限公司、安耐吉化学有限公司等购买，除特殊说明均不经过进一步的处理。100-200 目或 200-300 目硅胶购买于安徽良臣硅源材料有限公司。另外，所使用的无水试剂，均参照标准纯化方法获得。
2.1.2 实验主要仪器与设备
化学合成及化合物结构分析与检测所用的主要仪器和设备如下表 2-1 所示：
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2.2 实验方法
2.2.1 化合物库 1-3 的设计、合成及生物活性评价
2.2.1.1 化合物库 1-3 中小分子抑制剂的生物活性评价
1）SHP2 和 SHP1 抑制活性测试实验（分子水平）： 每次测试以 NSC-87877 作为阳性参照，在 384 孔板中，通过光吸收检测方法，测定待测物质对 SHP2 的抑制作用。即：将待测化合物溶解于 DMSO 中，并依次稀释至待测浓度，在 485 nm 和 530 nm 波长下通过 EnVision multilabe plate reader (Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA)检测底物 3-O-甲基荧光素磷酸盐（OMFP）的去磷酸化产物的吸光度以确定 SHP2 的酶活性。其中缓冲液终体积为 50μL，包括：50 mmol/L MOPS，pH 6.8、10 μmol/L OMFP，20 nmol/L 重组酶，2 mmol/L 二硫苏糖醇（DTT），1 mmol/L EDTA 和 2% DMSO。每个样品都设置复孔，在结果数据中以标准偏差（SD）表示。
去磷酸化作用的起始速率由酶促反应动力学曲线的早期线性区域表示，连续监测化合物的抑制活性。使用下式由抑制百分比[抑制（%）]与抑制剂浓度的非线性曲线拟合计算出 IC50值：抑制%= 100 / {1+（IC50 / [I] k}，其中 k 为斜率。
2）TCPTP 和 PTP1B 抑制活性测试实验（分子水平）：
与上述方法类似，在 96 孔板中进行比色测定合成化合物对 TCPTP 的抑制活性。将待测化合物溶于 DMSO 中，依次稀释至所需的浓度，于 405 nm 的吸光度下使用 SpectraMax 340 酶标仪检测底物对硝基苯基磷酸酯（pNPP）的水解产物变化，来确定 PTP1B 的酶活。缓冲液终体积为 100 μL，包括：50 mmol/L MOPS，pH 6.5、2 mmol/L pNPP，21 nmol/L GST-PTP1B or GTS-TCPTP 和 2％DMSO。每个样品都设置复孔，在结果数据中以标准偏差（SD）表示，每次测试阳性参照为 NSC-87877。
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第三章 结果与讨论 ................................ 26
3.1 聚焦化合物库 1 的设计合成及生物活性评价 ................................... 26
3.1.1 聚焦化合物库 1 的合成与表征 ................... 26
3.1.1.1 化合物 1-23 的合成与表征 .................................. 26
3.1.1.2 化合物 24-27 的合成与表征 ....................................... 32
主要结论与展望 ..................................... 59
主要结论 ......................................... 59
展望...................59
第三章 结果与讨论
3.1 聚焦化合物库1 的设计合成及生物活性评价
3.1.1 聚焦化合物库 1 的合成与表征
3.1.1.1 化合物 1-23 的合成与表征
药学论文参考
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主要结论与展望
主要结论
为丰富抑制剂的结构多样性，我们以课题组前期研究所发现的 SHP2 抑制剂 SMI-6b 为起点，改变中间杂环，设计并合成三类含五元杂环结构单元的化合物库， 共合成 68 个化合物，并进行了活性评价和选择性评价以及构效关系分析。活性结果表明：含 1，3，4-噻二唑结构单元的化合物 1 中，化合物 11 对TCPTP、PTP1B、SHP-1 和 SHP-2 都有一定的抑制作用，选择性差，化合物15，31-33 对 SHP2 的抑制活性低于 SHP1，尤其是化合物 32 对 SHP1 的抑制作用明显提高，且是对 SHP2 的 2.5 倍左右，对 PTP1B 和 TCPTP 没有活性，选择性相对较好。在血液瘤细胞 MV-4-11 有一定活性，IC50为 14.15±4.66 μM，并且我们用计算机模拟也可解释其对 SHP1 的选择性。构效关系表明 3-NO2和 4-NHCH3 以及呋喃环为维持或者提高化合物活性起到重要作用，为发展具有全新的分子骨架的 SHP1 抑制剂研究提供了思路。
在含 1，2-异恶唑类结构单元的化合物库 2 中 13 个化合物，我们进行了构效关系分析并做了活性评价，其中化合物 37 对 TCPTP 没有抑制活性，对 SHP2的 IC50为 4.71±0.67 μM，是对 SHP1 活性的 3 倍，是选择性相对较好的 SHP2 抑制剂。并且构效关系表明 3-NO2和 4-NHCH3在维持化合物活性中起到重要作用，并且这类化合物后续还有很大的改造空间，为后续 SHP2 的小分子抑制剂的设计提供经验。
参考文献（略）