大豆菌核病生防菌克Ｈ３菌株发酵条件研究

摘要：通过对大豆菌核病生防菌克H3菌株发酵条件的研究表明，适宜克H3菌株生长的培养基是自制培养基，最适温度35℃，适宜pH值7.0～8.5，最佳发酵时间48h，克H3生长曲线表明，6～18h为该菌延迟期，18～30h为对数生长期，30～54h为稳定期，54h后进入衰退期。
　　关键词：大豆菌核病；克H3；发酵条件
　　
　　1 材料与方法
　　
　　1．1　供试培养基
　　①PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL。②高氏1号培养基：可溶性淀粉20g，KNO31g，K2 HPO40.5g，MgSO3·7h3O 0.5g，Fe-SO40.01g，水1000mL。③肉汁蛋白胨培养基：牛肉膏5g，NaCl5g，蛋白胨10g，水1000mL。④玉米粉培养基：玉米粉300g，水1000mL。⑤YPG培养基：酵母浸膏8g，酵母膏2g，Kh3PO40.5g，K2HPO42g，水1000mL。灭菌后加入无菌10％葡萄糖50mL和1MMgSO4·7h3O1mL，pH值7.2。⑥BPY培养基：牛肉膏5g，酵母膏5g，葡萄糖5g，蛋白胨10g，NaCl5g，水1000mL。pH值7.2。⑦自制培养基：豆粉10g，葡萄糖10g，酵母膏5g，水1000mL。
　　
　　1．2 主要仪器设备
　　HYA恒温摇床(中国科学院武汉仪器厂)，O-lympus显微镜(日本奥林巴斯株式会社)，PHS-3C型酸度计(金坛市泰纳仪器厂)，电热恒温培养箱(南京电器三厂)，手提式高压灭菌锅(哈尔滨东联电子公司)，超净工作台(上海精密仪器仪表厂)。
　　
　　1．3 试验方法
　　
　　1·3．1 克H3菌株发酵液的制备
　　将活化的克H3菌株用接菌环划线接种于肉汁蛋白胨培养基斜面上，30℃恒温培养2d后，每试管用5mL无菌水配成克H3悬浮液，将5mL的克H3悬浮液置于装有100mL PDA培养液的250mL三角瓶中，在35℃、180r/min摇床中培养48h制成发酵液。
　　1．3．2 抑菌活性的测定方法
　　采用滤纸片法。在PDA培养基一侧放人直径8ram的已灭菌的圆形滤纸碟片，用移液枪接种克H3悬浮液5μL，另一侧放人核盘菌(6mm)，菌间相距3cm。每处理3次重复，5d观察拮抗效果，测量抑菌带宽度。
　　1．3．3 最佳培养基的选择
　　供试培养基为PDA培养基、高氏1号培养基、肉汁蛋白胨培养基、玉米粉培养基、YPG培养基、BPY培养基和自制培养基，将5mL的克H3发酵液分别置于装有100mL上述培养基的250mL三角瓶中，在35℃、180r/min摇床中震荡培养48h后，取发酵液测定抑菌活性。每处理3次重复。
　　1．3．4 培养温度的测定
　　处理温度为20～40℃，梯度为5℃，将5mL的克H3发酵液置于装有100mL自制培养基的250mL三角瓶中，在180r/min摇床中震荡培养48h后，取发酵液测定抑菌活性。每处理3次重复。
　　1．3．5 起始pH值的测定
　　用PHS-3C型酸度计将自制培养基中的pH值调节为5.5～10，间隔为0.5。将5mL的克H3发酵液置于装有100mL自制培养基的250mL三角瓶中，在35℃、180r/min摇床中震荡培养48h后，取发酵液测定抑菌活性，每处理3次重复。
　　1．3．6 培养时间的确定
　　将5mL的克H3发酵液置于装有100mL自制培养基的250mL三角瓶中，在35℃、180r/min摇床中震荡培养。每间隔12h取发酵液测定抑菌活性，至72h结束，共取样6次。
　　1．3．7 培养基装液量的确定
　　在250mL三角瓶中分别装入25、50、75、100、125、150mL的自制培养基，接种5％的克H3发酵液，在35℃、180r/min摇床中震荡培养48h后，取发酵液测定抑菌活性。
　　1．3．8 接种量的确定
　　分别按1、2、5、7、10、20、30mL接种量接人100mL自制培养基中，在35℃、180r/min摇床中震荡培养48h后，取发酵产物测定抑菌活性。
　　1．3．9 摇床转速的确定
　　250mL三角瓶中装入自制培养基100mL，接种5mL克H3发酵液后，分别在160、180、200、220r/min摇床中35℃震荡培养48h后，取发酵液产物测定抑菌活性。
　　1．3．10 克H3菌株生长曲线
　　在250mL三角瓶中装入100mL自制培养基，加入克H3发酵液5mL，在最适温度、最适pH值下180r/min恒温振荡培养后，以6h为时间间隔取样，即6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72h分别取样，稀释平板法测定每毫升菌落个数。
　　
　　2 结果与分析
　　
　　2．1 不同培养基对克H3抑菌活性的影响
　　玉米粉培养基、PDA培养基培养的克H3菌株抑菌活性较差，抑菌带宽＜10mm，高氏l号培养基、肉汁蛋白胨培养基、YPG培养基、BPY培养基和自制培养基培养的克H3菌株对核盘菌的抑菌活性较强，其中自制培养基的抑菌活性最强，抑菌带宽11.7mm。
　　
　　2．2 不同温度对克H3抑菌活性的影响
　　结果表明，20～40℃克H。菌株对核盘菌均有抑菌活性。20～25℃克H3菌株抑菌活性较弱，抑菌带宽＜(10mm；30～35℃克H3菌株抑菌活性较强，其中35℃抑菌活性最强，抑菌带宽11.9mm；当温度超过35℃，随着温度的升高克H3抑菌活性逐渐下降。 转贴于 免费论文下载中心
　　2．3 不同pH值对克H3抑菌活性的影响
　　结果表明，pH值5.5～10克H3菌株对核盘菌均有抑菌活性，pH值5.5～6.5克H3抑菌活性较弱，抑菌带宽＜10mm；pH值7.0～8.5克H3抑菌活 性强，其中pH值8.0时抑菌活性最强，抑菌带宽12.1mm pH值＞8.5时，克H3抑菌活性下降，但变化幅度不大。适合克H3发酵的pH值范围7.0～8.5。
　　2．4 不同培养时间对克H3抑菌活性的影响
　　结果表明，克H3菌株发酵培养12h时，发酵产物抑菌活性非常弱，抑菌带宽＜5mm；12h后抑菌活性逐渐增强，至48h抑菌活性最强，抑菌带宽11.9mm，培养时间超过48h后，随着时间的延长克H3抑菌活性逐渐下降。克H3发酵时间范围为36～48h，最佳发酵时间48h。
　　
　　2．5 不同装液量对克H3抑苗活性的影响
　　结果表明，培养基装液量25～100mL时，克H3菌株发酵液的抑菌活性变化不大，当装液量＞100mL时，随着装液量的增加克H3抑菌活性逐渐下降。
　　
　　2．6 不同接种量对克H3抑菌活性的影响
　　结果表明，接种量1～5mL时，随着接种量的增加克H3抑菌活性逐渐增强，接种量5～10mL时，抑菌活性变化不大，接种量＞10mL时，随着接种量的加大克H3抑菌活性逐渐下降。
　　
　　2．7 摇床速度对克H3抑菌活性的影响
　　结果表明，不同摇床速度对克H3抑菌活性有影响，转速160、180r/min时抑菌活性较强，其中180r/min时抑菌活性最强；转速超过180/min时，随着转速的增加克H3抑菌活性逐渐下降。因此，克H3菌株发酵的最佳摇床速度为180r/min。
　　
　　2．8 克H3菌株生长曲线
　　图1表明，6～18h克H3菌落个数较少，增加缓慢，为克H3延迟期；18～30h克H3菌落个数急剧增加，为对数生长期；30～54h克H3菌落个数变化不大，为克H3稳定期，时间超过54h，随着培养时间的延长克H3菌落个数逐渐减少，为克H3衰退期。
　　
　　3 讨论与分析
　　
　　通过对克H3菌株发酵条件的研究表明，适宜克H3菌株生长的培养基是自制培养基；适宜温度30～35℃，最适温度35℃；适宜pH值7.0～8.5；适宜发酵时间36～48h，最佳发酵时间48h；适宜装液量25～100mL，推荐100mL装液量；适宜接种量5～10mL，推荐接种量5mL；适宜摇床速度160～180r/min，最佳摇床速度180r/min；克H3生长曲线表明，6～18h为该菌延迟期，18～30h为对数生长期，30～54h为稳定期，54h后进入衰退期。微生物活性受培养基的制约，装液量反映发酵液菌体需氧状况，随着装液量的增加克H3抑菌活性逐渐下降，说明克H3为好氧细菌。细菌延迟期的长短与菌种遗传性、菌龄及移种至新鲜培养基前后所处的环境条件是否相同等因素有关系，短的几分钟，长的可达几小时，而克H3的延迟期为18h，这在细菌里属于比较长的。由于延迟期的存在延长微生物的正常生长周期，对于如何缩短克H3延迟期，提高设备利用率，降低成本应进一步深入研究。 免费论文下载中心